【摘要】：Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)和Rho GTPase激活蛋白(GTPase activating proteins, GAPS)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)被用于激活特殊Rho GTPase家族成員,因而引發(fā)多種調(diào)節(jié)神經(jīng)的形態(tài)、生長和可塑性的信號機(jī)制,在一些位置通過它們影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。Kalirin是一個(gè)大的神經(jīng)雙Rho GEF,它通過其兩個(gè)Rho GEF區(qū)激活Rac1 RhoA和RhoG。這個(gè)激活受時(shí)間和空間上的調(diào)控,并允許Kalirin影響神經(jīng)突(neurite)的起始、軸突生長和樹突狀形態(tài)形成。這個(gè)選擇性剪接基因產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄,其產(chǎn)生的蛋白定位在突觸后致密區(qū)(postsynaptic density, PSD)。樹突棘的形成需要與PSD-95相互作用的Kalirin-7。而且,Kalirin能調(diào)節(jié)和影響神經(jīng)形態(tài)形成的其他方面,這通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間不同的區(qū)域相互作用完成,包括很多血影蛋白(spectrin)區(qū)、其他蛋白及脂類相互作用區(qū),還可以和一個(gè)潛在的激酶相互作用。這些相互作用提示,其不僅與神經(jīng)形態(tài)發(fā)生有關(guān),也與囊泡運(yùn)輸、分泌、神經(jīng)維護(hù)和神經(jīng)變性的疾病有關(guān)。 樹突棘結(jié)構(gòu)和功能上的改變促進(jìn)多種生理過程,例如突觸傳遞和突觸可塑性,進(jìn)而表現(xiàn)與行為上,其中包括學(xué)習(xí)與記憶。另外,樹突棘形態(tài)發(fā)生和可塑性的改變是很多神經(jīng)發(fā)育紊亂和神經(jīng)病紊亂的一種內(nèi)在表現(xiàn)型。因此,在近些年中關(guān)于調(diào)節(jié)樹突棘可塑性的分子機(jī)制,及相關(guān)的病理分子機(jī)制一直是一個(gè)研究熱點(diǎn)。近來一系列的研究明確了Kalirin-7是樹突棘發(fā)育過程中重要的調(diào)節(jié)因子,也是樹突棘結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性中重要的調(diào)節(jié)因子,這些使我們對樹突棘的動(dòng)態(tài)變化有了進(jìn)一步的理解,同時(shí)提供了一個(gè)關(guān)于樹突棘結(jié)構(gòu)可塑性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制模型,該模型說明了Kalirin-7在一些機(jī)能紊亂性疾病(包括精神分裂癥和阿爾茨海默癥)的突觸病理中的作用。 我們合成了Kalirin-7 C末端的19個(gè)氨基酸的序列和一個(gè)半胱氨酸殘基的由20個(gè)氨基酸組成的短肽。這條20個(gè)氨基酸的短肽是半抗原,用BMS(m-maleimidobenzoy-N-hydoxysuccinimide ester)將這條短肽與KLH(鑰孔嘁藍(lán)蛋白)交聯(lián)起來,制備成抗原,免疫雌性Balb/c小鼠。第三次免疫后的第9天測血清效價(jià),3號小鼠效價(jià)最高,為1：6.4x104。取3號小鼠脾臟中的B淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)過細(xì)胞克隆化后,最終獲得分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞兩株,3C4和4G7,并制備出相應(yīng)的抗體。 抗體鑒定結(jié)果如下：(1)對篩選出的兩株抗Kalirin-7的抗體的單克隆細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行鑒定,測定3C4亞類為IgG1,4G7亞類為IgG2a,它們亞型均為Kappa;(2)用間接ELISA檢測的方法測得抗Kalirin-7的抗體3C4小鼠腹水效價(jià)為1：4×104,4G7小鼠腹水效價(jià)為1：2×104；(3)用間接ELISA檢測的方法測得抗Kalirin-7的單克隆抗體3C4親和力常數(shù)為2.25x 10~(11),4G7親和力常數(shù)為3.64×109；(4)免疫組化鑒定結(jié)果良好。
[Abstract]:Rho guanine nucleotide exchange factor (guanine nucleotide exchange factors, GEFs) and Rho GTPase activator (GTPase activating proteins, GAPS) (GTPase activating proteins, GAPS) are used to activate special Rho GTPase family members in the central nervous system (Central nervous system, CNS). The signaling mechanism of growth and plasticity through which actin cytoskeleton is affected at some point. Kalirin is a large neural double Rho GEF, that activates Rac1 RhoA and RhoG. through its two Rho GEF regions This activation is regulated by time and space and allows Kalirin to affect the initiation, axon growth and dendritic formation of (neurite). This selective splicing gene product is further transcribed and the resulting protein is located in the postsynaptic dense region of (postsynaptic density, PSD). The formation of dendritic spine requires Kalirin-7. to interact with PSD-95 Moreover, Kalirin regulates and affects other aspects of neuromorphogenesis, through protein-protein interactions in different regions, including many of the (spectrin) regions of the hemosiderin, and other protein and lipid interactions. It can also interact with a potential kinase. These interactions suggest that they are related not only to neuromorphogenesis, but also to vesicular transport, secretion, nerve maintenance and neurodegenerative diseases. Structural and functional changes in dendritic spine promote a variety of physiological processes, such as synaptic transmission and synaptic plasticity, which in turn contribute to performance and behavior, including learning and memory. In addition, the morphogenesis and plasticity of dendritic spine is an intrinsic phenotype of many neurodevelopmental disorders and neuropathic disorders. Therefore, in recent years, the molecular mechanism of regulating the plasticity of dendritic spine and related pathological molecular mechanism has been a hot topic. A series of recent studies have confirmed that Kalirin-7 is an important regulatory factor in the development of dendritic spine, and is also an important regulatory factor in structural and functional plasticity of dendritic spine, which gives us a better understanding of the dynamic changes of dendritic spine. A molecular regulatory model for structural plasticity of dendritic spine is provided, which illustrates the role of Kalirin-7 in synaptic pathology of some dysfunctional diseases, including schizophrenia and Alzheimer's disease. We synthesized 19 amino acids at the C-terminal of Kalirin-7 and a short peptide consisting of 20 amino acids with cysteine residues. The 20 amino acid short peptide was hapten. The peptide was cross-linked with KLH (keyhole chirin) by BMS (m-maleimidobenzoy-N-hydoxysuccinimide ester) to prepare the antigen and immunize female Balb/c mice. On the 9th day after the third immunization, the titer of 3 mice was the highest (1: 6.4x104). B lymphocytes from the spleen of mouse No. 3 were fused with SP2/0 cells. After cell cloning, two hybridoma cell lines, 3C4 and 4G7, which secreted antibodies, were obtained and the corresponding antibodies were prepared. The results of antibody identification were as follows: (1) the cell culture medium of two monoclonal cells against Kalirin-7 antibody was identified. 3C4 subclass was IgG1,4G7 subclass: IgG2a,. Their subtypes were Kappa; (2) the ascites titer of anti-Kalirin-7 antibody 3C4 mice was 1:4 脳 104G7 and 1:2 脳 104by indirect ELISA detection. (3) the affinity constant of 3C4 and 4G7 was 2.25x 1011 and 3.64 脳 10 ~ (9) by indirect ELISA detection. (4) Immunohistochemistry showed that the affinity constant of monoclonal antibody against Kalirin-7 was good, and the affinity constant of 4G7 was 3.64 脳 10 ~ (9). (4) Immunohistochemical analysis showed that the affinity constant of 3C4 and 4G7 was good.
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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本文編號：2270620