【摘要】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞初始接種密度對成骨誘導(dǎo)分化影響的初步研究 目的 主要研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、原代培養(yǎng),擴(kuò)增純化、流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型鑒定,以及對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞初始接種密度對成骨誘導(dǎo)分化影響等生物特性的初步研究,為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程研究進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。 方法 (1)取材無菌條件下取湘雅醫(yī)院手術(shù)室婦產(chǎn)科健康孕婦足月剖腹產(chǎn)臍帶組織標(biāo)本15份,于手術(shù)室內(nèi)無菌條件下解剖去除臍帶動靜脈,無菌PBS洗去積血,放入事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基送至湘雅醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞房備用。 (2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定：在無菌操作臺內(nèi)將準(zhǔn)備好的臍帶組織剪碎至1mm3組織塊,采用Ⅱ型膠原蛋白酶消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞。待原代細(xì)胞培養(yǎng)成功,流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞表型。 (3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng),及其生長曲線繪制。原代細(xì)胞培養(yǎng)、并鑒定后,傳代培養(yǎng)至第3代時,采用臺盼藍(lán)染色記數(shù)活細(xì)胞數(shù)量,記錄結(jié)果,以時間為橫坐標(biāo),活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。 (4)不同細(xì)胞接種密度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)：將第3代細(xì)胞以三種不同接種密度(1×105ml,1×106/ml,1×107/ml)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)18天,其中每種細(xì)胞長滿后,記錄每組收獲細(xì)胞總數(shù)量及培養(yǎng)時間分別繪制生長曲線。 (5)初始接種細(xì)胞密度對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化的作用研究：將第3代細(xì)胞按前述三種接種密度分組接種至細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液含1.0×10-7mol/L地塞米松,50mg/L抗壞血酸,50mg/L維生素C,1.0×10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉及DMEM/高糖培養(yǎng)基。鑒定誘導(dǎo)分化后成骨細(xì)胞采用(1)堿性磷酸酶試劑盒染色法。(2)茜紅素染色法。 所有結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X士s)表示,用SPSS.17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,組間差異性比較在方差齊性檢驗(yàn)后,采用單因素方差分析(ANOVA-LSD)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 (1)來源于人臍帶Wharton's jelly膠的單個核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后表現(xiàn)為間充質(zhì)樣的細(xì)胞,間充質(zhì)細(xì)胞呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。 (2)第3,5,7代細(xì)胞生長曲線基本相同。生長共同特性：細(xì)胞接種后24小時內(nèi)貼壁,傳代培養(yǎng)潛伏期約為24-36小時；傳代培養(yǎng)對數(shù)增殖期約為3-5天,在該階段細(xì)胞生長活躍,增勢迅速,持續(xù)4-5d；對數(shù)增殖期結(jié)束后4-5天,細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期。 (3)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的抗原CD 105, CD44,不表達(dá)造血干細(xì)胞抗原CD34, CD45,與源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞一致,只是來源不同。 (4)不同初始接種密度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨誘導(dǎo)分化差異顯著(p0.05),1×106/ml細(xì)胞初始接種密度組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨誘導(dǎo)分化優(yōu)于其他兩密度組。 結(jié)論 人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞能在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,并且具有和骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞類似的生物形態(tài)和抗原表型,能夠向成骨誘導(dǎo)分化,且最合理的成骨誘導(dǎo)初始接種密度約為1×106/ml。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2258562