【摘要】：高靈敏的病毒檢測在食品安全,疾病防控與治療,以及生物安全等方面均至關重要。隨著科學技術的進步,各種檢測方法得到了大大地發(fā)展,但是目前仍缺乏適合現(xiàn)場運用的高靈敏的檢測方法。以禽流感病毒為例,自禽流感病毒被發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)造成多次世界范圍內禽類或者人類疑似流感的大流行。目前,禽流感病毒檢測的標準方法是在雞胚或者細胞中對病毒進行分離擴增,并使用血清學方法確認病毒類型,該方法步驟繁瑣,一般需要1-2周的時間才能得到結果,不能實現(xiàn)快速的現(xiàn)場檢測。其他常用的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISAs)和基于分子生物學的核酸擴增方法(PCR)。由于臨床樣品成分復雜和待檢測物質濃度低,臨床樣品的檢測對檢測方法的靈敏度、穩(wěn)定性、可靠性有著很高的要求；同時,面向現(xiàn)場的臨床樣品的檢測要求檢測方法操作簡便、便攜性強、無需復雜儀器,因此,酶聯(lián)免疫方法(ELISA)和常規(guī)的PCR方法還無法實現(xiàn)面向現(xiàn)場的高靈敏、穩(wěn)健的檢測。 基于微/納米磁球的免疫磁分選方法能將低濃度的目標物從復雜的樣品環(huán)境中識別和分離,降低非特異性物質的干擾；同時,利用熒光納米材料量子點的穩(wěn)定高亮的熒光,使用量子點作為標記材料可以提高檢測的靈敏度。將微/納米磁球的磁分選與熒光量子點標記結合起來的方法在高靈敏病原體檢測中有著很好的運用前景；并且由于該方法具有操作簡便、原理普適、無需人員操作培訓等優(yōu)點,該方法有望實現(xiàn)在現(xiàn)場以及臨床病毒檢測。因此,本論文致力于構建可運用于實際樣品的現(xiàn)場檢測的穩(wěn)健方法,將微/納米磁球的磁分選與熒光量子點標記結合起來用于禽流感病毒H9N2高靈敏、穩(wěn)定的檢測。本論文主要完成了以下工作： 1.以禽流感病毒H9N2為例,構建了一種基于免疫磁分離和熒光量子點標記的穩(wěn)健的可運用于現(xiàn)場的高靈敏禽流感病毒檢測方法。該方法通過在納米磁球表面修飾抗H9N2膜蛋白HA的單克隆抗體,實現(xiàn)了即使在復雜環(huán)境中H9N2病毒的準確捕獲和分離；利用免疫夾心策略,通過生物素化的抗體引入偶聯(lián)了鏈酶親和素的熒光半導體材料量子點,實現(xiàn)對目標病毒高靈敏的檢測。該方法特異性強、靈敏度高,可實現(xiàn)200μL樣品中60個病毒的檢測,是目前最靈敏的病毒檢測方法之一。同時,該方法具有很好的可重復性和穩(wěn)定性,其批次內變異系數(shù)為1.35%,批次間變異系數(shù)為3.30%。并且,該方法可高選擇性的檢測復雜生物樣品(破碎的組織和禽類糞便)中的病毒。30個禽類咽拭子臨床樣品的雙盲測試驗證結果符合率高達96.7%,說明該方法具有很好的可靠性。因此,該方法在實際樣品的現(xiàn)場檢測中有著廣闊的運用前途。并且由于其普適的檢測原理,該檢測方法可推廣至其他病毒的檢測。 2.研究了納米磁球捕獲病毒過程的動力學。在這個體系中,用于捕獲的納米級別免疫磁球與病毒有著相當?shù)某叽?100-200nm),因此研究免疫磁球捕獲病毒過程的動力學有助于了解納米級別的顆粒之間的反應動力學。我們發(fā)現(xiàn),在免疫磁球大大過量的情況下,該捕獲過程類似于雙分子準一級反應,其捕獲速率常數(shù)kf為4.25×109(mol/L)-1s-1,且捕獲90%的病毒僅需15分鐘。 3.從禽流感病毒感染宿主細胞時病毒識別和結合的細胞表面a-2,3-唾液酸-半乳糖酸受體(α-2,3sialic acid-Gal linkage)受到啟發(fā),在特定唾液酸酶的作用下,將唾液酸通過α-2,3糖苷鍵連接到偶聯(lián)了半乳糖的量子點的表面以模擬細胞表面唾液酸受體結構,成功制備唾液酸修飾的量子點,并嘗試對禽流感病毒H9N2進行標記。 4.基于免疫磁分選和熒光量子點標記高靈敏檢測病毒方法的原理,在禽流感病毒被磁球捕獲后,初步建立了利用修飾了a-2,3唾液酸的量子點(α-2,3-SA-QDs)對被捕獲的禽流感病毒進行識別并檢測的新方法。
[Abstract]:With the development of science and technology, a variety of detection methods have been greatly developed, but there is still a lack of highly sensitive detection methods suitable for field use. At present, the standard method of avian influenza virus detection is to isolate and amplify the virus in chicken embryos or cells, and use serological methods to confirm the type of the virus. This method is cumbersome and usually takes 1-2 weeks to get the results. Other commonly used detection methods are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) and DNA amplification based on molecular biology (PCR). Because of the complexity of clinical samples and the low concentration of the substances to be detected, the detection of clinical samples requires high sensitivity, stability and reliability of detection methods. In order to detect clinical samples on the spot, it is required that the method is simple, portable and does not need complicated instruments. Therefore, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and conventional PCR methods can not achieve high sensitivity and robustness on the spot.
Immunomagnetic separation method based on micro/nano magnetic spheres can identify and separate low concentration targets from complex sample environments and reduce the interference of non-specific substances. At the same time, using stable and bright fluorescence of fluorescent nano-material quantum dots, using quantum dots as marker materials can improve the detection sensitivity. The combination of sphere magnetic sorting and fluorescent quantum dot labeling has a good application prospect in the detection of highly sensitive pathogens; and because this method has the advantages of simple operation, universal principle, no need for personnel training, this method is expected to achieve in-situ and clinical virus detection. A robust method for in-situ detection of avian influenza virus H9N2 was developed by combining magnetic separation of micro/nano magnetic spheres with fluorescent quantum dot labeling.
1. Taking H9N2 avian influenza virus as an example, a robust and in-situ detection method for avian influenza virus based on immunomagnetic separation and fluorescent quantum dot labeling was constructed. The method can capture H9N2 virus accurately even in complex environment by modifying monoclonal antibodies against H9N2 membrane protein HA on the surface of nano-magnetic spheres. The method has strong specificity and high sensitivity, and can detect 60 viruses in 200 mu L samples. It is one of the most sensitive methods to detect viruses. The intra-batch and inter-batch variability coefficients were 1.35% and 3.30%, respectively. The method can be used to detect virus in complex biological samples (broken tissues and poultry feces) with high selectivity. The coincidence rate of double-blind test was 96.7% in 30 poultry pharyngeal swabs. Therefore, this method has a broad application prospect in the field detection of real samples. And because of its universal detection principle, this method can be extended to other virus detection.
2. The kinetics of virus capture by nano-magnetic spheres was studied. In this system, the nano-sized immunomagnetic spheres used for capture have the same size as the virus (100-200 nm). Therefore, the kinetics of virus capture by immunomagnetic spheres is helpful to understand the reaction kinetics between nano-sized particles. In the case of large excess, the capture process is similar to the bimolecular quasi-first order reaction. The capture rate constant KF is 4.25 *109 (mol/L) -1s-1, and it takes only 15 minutes to capture 90% of the virus.
3. Inspired by the virus's recognition and binding of a-2,3-sialic acid-galactic acid receptor (a-2,3-sialic acid-Gal linkage) on the surface of cells infected with avian influenza virus, sialic acid was linked to the surface of quantum dots coupled with galactose via a-2,3-glycoside bond under the action of a specific sialic enzyme to simulate saliva on the cell surface. The acid receptor structure has successfully prepared sialic acid modified quantum dots and attempted to mark the avian influenza virus H9N2.
4. Based on the principle of immunomagnetic sorting and fluorescent quantum dot labeling, a new method for the identification and detection of avian influenza virus was established by using a-2,3-SA-QDs modified with a-2,3-sialic acid (a-2,3-SA-QDs).
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1;O657.1

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