【摘要】：目的:以原核表達的人源類溶菌酶蛋白4(LYZL4)為免疫原制備多克隆抗體,檢測LYZL4在睪丸組織中的定位,為闡明其生理功能提供依據(jù)。方法:將LYZL4編碼基因克隆于原核表達載體pET32a,IPTG誘導重組LYZL4(r LYZL4)表達。分別使用Ni-NTA樹脂和甲殼素親和層析純化rLYZL4,采用雙層瓊脂平板擴散法檢測殺菌活性。以Ni-NTA樹脂純化產(chǎn)物為免疫原制備兔抗rLYZL4多克隆抗體,通過ELISA測定抗體效價,Western印跡檢測抗體特異性后,檢測LYZL4蛋白在人體各組織的分布及其在精子和精漿中存在情況,免疫組化確認LYZL4在人睪丸組織中的定位。結(jié)果:原核表達系統(tǒng)可有效表達rLYZL4,其對溶壁微球菌及大腸桿菌無殺滅活性。制備的兔抗rLYZL4多克隆抗體具有很高的效價和特異性,在睪丸、附睪及人精子蛋白提取物中可檢測到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圓形精子細胞及長形精子細胞的頂體上。結(jié)論:本研究成功以原核表達的rLYZL4制備了該蛋白的多克隆抗體,確認LYZL4在睪丸和附睪有表達,并定位于精子頂體上,提示其可能與頂體結(jié)構或功能相關。
[Abstract]:Aim: to prepare polyclonal antibodies against human lysozyme protein 4 (LYZL4) expressed in prokaryotic cells and to detect the localization of LYZL4 in testis and provide evidence for elucidating its physiological function. Methods: LYZL4 encoding gene was cloned into prokaryotic expression vector pET32a,IPTG to induce recombinant LYZL4 (r LYZL4) expression. RLYZL4, was purified by Ni-NTA resin and chitin affinity chromatography respectively. The bactericidal activity was detected by double layer Agar plate diffusion method. Rabbit anti rLYZL4 polyclonal antibody was prepared by using purified Ni-NTA resin as immunogen. The specificity of the antibody was detected by ELISA assay. The distribution of LYZL4 protein in human tissues and its presence in spermatozoa and seminal plasma were detected. Immunohistochemistry confirmed the localization of LYZL4 in human testis. Results: prokaryotic expression system could express rLYZL4, effectively. It had no killing activity against micrococcus and Escherichia coli. The rabbit polyclonal antibody against rLYZL4 has high titer and specificity. LYZL4 can be detected in testis, epididymis and human sperm protein extract, and LYZL4 is located on acrosome of round spermatocytes and long sperm cells in seminiferous tubules. Conclusion: the polyclonal antibody of rLYZL4 expressed in prokaryotic cells was successfully prepared in this study. It was confirmed that LYZL4 was expressed in testis and epididymis and located on acrosome of spermatozoa, suggesting that it might be related to the structure or function of acrosome.
【作者單位】： 上海健康醫(yī)學院基礎醫(yī)學院;上海健康醫(yī)學院藥學院;上海紐約大學文理學部;
【基金】：上海市自然科學基金(15ZR1421800) 上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目(15ZZ116) 上海市青年科技英才揚帆計劃(15YF1408600)~~
【分類號】：R392.11

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本文編號：2224690