【摘要】：Ror2（The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor）是RTKs家族中的一員，為單次跨膜受體，在人類的骨骼發(fā)育和癌癥發(fā)生中發(fā)揮了十分重要的作用。在哺乳動物例如小鼠中，Ror2突變體小鼠呈面部畸形，四肢和尾部短小，呼吸系統(tǒng)功能障礙，最終導致新生小鼠致死。在爪蛙中的研究發(fā)現(xiàn)，XRor2及其突變體干擾了原腸期的匯聚延伸運動。因此，Ror2在早期胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作用，所以我們利用斑馬魚胚胎體外發(fā)育及早期透明等優(yōu)勢，對Ror2在早期胚胎發(fā)育中的功能進行深入研究。前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Ror2在小鼠和爪蛙中作為一類非Frizzled受體，能夠與Wnt5a相互作用調節(jié)CE運動。 匯聚延伸（CE）運動是原腸胚期的一種重要的細胞運動形式，在脊椎動物早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮了十分重要的作用。值得注意的是，多種遺傳學證據(jù)強調了在斑馬魚胚胎原腸胚期調節(jié)CE運動的重要性。雖然Ror2在小鼠和爪蛙中能夠與Wnt5a相互作用調節(jié)CE運動，然而斑馬魚中，Wnt5a在原腸胚時期的表達量很低，而且Wnt5a敲降后也沒有引起CE缺陷的表型。然而斑馬魚中Wnt11的突變體slb顯示了缺陷的CE運動，之前的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚Wnt11能夠與Frizzled-7和Flamingo相互作用調節(jié)細胞運動，那么斑馬魚中Wnt11是否能通過Ror2發(fā)揮功能呢？Hiroki Hikasa等研究表明XRor2與XWnt11，Xfz7的共過表達能夠協(xié)同抑制匯聚延伸運動。生化實驗表明，XRor2的胞外結構域CRD能夠與XWnt11相結合，這一研究結果為我們提供了一些信息，但是并未有研究報道Wnt11和Ror2體內的相互作用功能。因此，以上的論述使我們提出了一些疑問，在斑馬魚中Ror2是否能夠在CE運動中發(fā)揮功能? Wnt11對CE運動的調節(jié)作用是否是通過Ror2的介導？Ror2與Wnt11是否能夠相互結合？這些問題目前還沒有得到解答。本研究的目的就是對上述疑問依次進行探討。 我們首先克隆得到了斑馬魚的Ror2基因，通過序列比對發(fā)現(xiàn)斑馬魚Ror2與人、小鼠和爪蛙的Ror2同源性極高。通過RT-PCR分析顯示，Ror2為母源性基因，且隨后的各胚胎時期均有表達，并且值得一提的是，Ror2在6-9hpf表達量較高，這暗示著Ror2有可能在原腸胚期發(fā)揮作用。Ror2的過表達抑制了胚胎在原腸胚期的匯聚和遷移，導致了嚴重的CE缺陷表型，暗示著Ror2在原腸胚期的CE運動中發(fā)揮了一定的調節(jié)作用。 Ror2和Wnt11共過表達能協(xié)同加強CE缺陷表型，并且原位雜交markers（hgg、dlx3b、ntl）檢測也證明了這一結果，這暗示著斑馬魚Wnt11可能通過Ror2調節(jié)CE運動。Ror2MOs敲降實驗顯示，在原腸胚期Ror2敲降后并沒有導致CE缺陷，，產(chǎn)生這一結果的原因，我們猜測是由于胚胎中存在Ror2的母源性蛋白，而TB MO并不能將其母源性蛋白封閉住，因此敲降表型不明顯。所以，我們隨后又改用Ror2dominant negative形式Ror2-TM進行敲降。結果顯示，dnRor2能夠導致較為嚴重的CE缺陷，并且隨后的時期胚胎眼部間距變窄，甚至出現(xiàn)獨眼表型，表型與wnt11/silberblick突變體表型類似，暗示著斑馬魚Wnt11可能會通過Ror2調控CE運動。因此我們同樣將Wnt11MO和dnRor2進行低劑量共顯微注射，結果同樣表明兩者的協(xié)同加成作用，并且進一步暗示了Wnt11與Ror2的相互作用。而Wnt11mRNA與dnRor2共過表達，顯著削弱了Wnt11mRNA引起的CE缺陷的表型，這一研究從另一方面暗示了兩者的相互作用性。因此為了直接證明這一假設，我們運用co-ip實驗進行驗證，結果也證明了Wnt11的確能夠與Ror2相結合。為了進一步研究Wnt11通過Ror2調控CE運動過程中發(fā)揮重要作用的位點，我們構建了Ror2突變體，結果表明Ror2-Y647和-S863位點均能在此過程中發(fā)揮作用。 通過以上研究表明，在斑馬魚中，Wnt11能夠與Ror2結合，從而調控了原腸胚期的匯聚延伸運動，而且這一調控作用中Ror2的Y647和S863位點是不可缺少的。這一研究結果不僅進一步認識了匯聚延伸這種重要的細胞運動形式，開拓了脊椎動物中對匯聚延伸運動的研究視野，而且對脊椎動物的早期胚胎發(fā)育研究提供了一定的理論依據(jù)。
[Abstract]:Ror2 (The receptor tyrosine kinase-like orphan receptor) is a member of the RTKs family. It is a single transmembrane receptor and plays an important role in human skeletal development and cancer. In mammals such as mice, the Ror2 mutant mice exhibit facial deformities, short limbs and tail, respiratory dysfunction, and ultimately lead to the development of cancer. It was found that XRor2 and its mutants interfered with the convergence and extension of the gastrula. Therefore, Ror2 may play an important role in the early embryonic development, so we used the advantages of zebrafish embryo development in vitro and early transparency to study the function of Ror2 in early embryonic development. Previous studies have shown that Ror2, as a non-Frizzled receptor, interacts with Wnt5a to regulate CE movement in mice and frogs.
Convergence elongation (CE) movement is an important form of cell movement in the gastrula and plays an important role in the early embryonic development of vertebrates. It is noteworthy that genetic evidence underlines the importance of regulating CE movement in the gastrula of zebrafish embryos. Interaction regulates CE movement, however, in zebrafish, Wnt5a expression is low during gastrula embryogenesis, and Wnt5a knockdown does not cause CE deficiency phenotype. However, the mutant SLB of Wnt11 in zebrafish shows defective CE movement. Previous studies have found that Wnt11 interacts with Frizzled-7 and Flamingo to regulate cell transport. Biochemical experiments show that the extracellular domain CRD of XRor2 can be combined with XWnt11, which provides some information for us, but no research has been done. The interaction between Wnt11 and Ror2 in vivo is reported. Therefore, the above discussion makes us question whether Ror2 can play a role in CE movement in zebrafish, whether Wnt11 mediates CE movement through Ror2, and whether Ror2 and Wnt11 can combine with each other. The purpose of this study is to discuss these questions in turn.
We first cloned the Ror2 gene from zebrafish and found that Ror2 was highly homologous to human, mouse and frog by sequence alignment. RT-PCR analysis showed that Ror2 was a maternal gene and was expressed in all subsequent embryonic stages. The overexpression of Ror2 inhibits the convergence and migration of embryos in gastrula, leading to severe CE deficiency phenotypes, suggesting that Ror2 plays a regulatory role in the CE movement in gastrula.
Co-expression of Ror2 and Wnt11 could synergistically enhance CE deficiency phenotype, and in situ hybridization markers (hgg, dlx3b, ntl) test also confirmed this result, suggesting that zebrafish Wnt11 may regulate CE movement through Ror2. Ror2MOs knockdown test showed that Ror2 knockdown did not lead to CE deficiency in gastrula embryo, we guess the reason for this result. The knockdown phenotype was not obvious because of the presence of Ror2 maternal protein in the embryo and the fact that TB MO could not block its maternal protein. Therefore, we then knocked down Ror2-TM in the Ror2 dominant negative form. The results showed that dnRor2 could cause serious CE defects and subsequent changes in the ocular spacing of the embryo. Narrow or even monocular phenotypes, similar to the wnt11/silberblick mutant phenotype, suggest that zebrafish Wnt11 may regulate CE movement through Ror2. Therefore, we also injected Wnt11MO and dnRor2 into low-dose co-microinjections. The results also showed that Wnt11MO and dnRor2 had synergistic additive effects and further suggested the interaction between Wnt11 and Ror2. The co-expression of Wnt11 mRNA and dnRor2 significantly weakened the phenotype of CE deficiency caused by Wnt11 mRNA, which implied the interaction between Wnt11 mRNA and dnRor2 on the other hand. Therefore, in order to directly prove this hypothesis, we used co-Ip experiment to verify the results, which also proved that Wnt11 can indeed combine with Ror2. We constructed a Ror2 mutant through the site of Ror2 which plays an important role in the regulation of CE movement. The results showed that both Ror2-Y647 and -S863 sites can play a role in this process.
In zebrafish, Wnt11 can bind to Ror2, thus regulating the convergence and extension of gastrula embryo, and the Y647 and S863 loci of Ror2 are indispensable in this regulation. This study not only further understands the important cell movement pattern of convergence and extension, but also opens up new avenues in vertebrates. It provides a theoretical basis for the study of early embryonic development of vertebrates.
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R-332

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本文編號：2216909