發(fā)布時間：2018-08-22 07:10

【摘要】：目的:優(yōu)化人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1(human papillomavirus type 16 major capsid protein L1,HPV16L1)在畢赤酵母中的表達,并考察可能的影響因素。方法:四個不同序列特征的HPV16L1基因M16、Y16、P16、W16(其中,M16和Y16按酵母密碼子優(yōu)化,P16為哺乳動物細胞密碼子優(yōu)化,而W16為野生型序列)分別克隆于畢赤酵母表達質(zhì)粒p PinkTM-HC(高基因拷貝菌落篩選)和p PinkTM-LC(低基因拷貝菌落篩選),并轉(zhuǎn)化不同蛋白酶缺陷的宿主菌。甲醇誘導24小時后,取菌體樣品經(jīng)Western blot分析L1蛋白的表達。結(jié)果:M16顯示了最高的表達水平,其次是Y16與P16,而W16幾乎無表達�；蛐蛄忻艽a子應(yīng)用特征分析顯示,4個基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)從高到低依次為Y16、M16、W16和P16。通過自由能和GC含量分析4個序列的mRNA二級結(jié)構(gòu),Y16為-409.40 kcal/mol和43.85%;M16為-451.50 kcal/mol和47.83%;P 16為-606.50kcal/mol and 64.10%;W16為-384.70 kcal/mol and 38.01%。蛋白酶缺陷菌株L1表達高于野生型菌株,質(zhì)粒p PinkTM-HC與p PinkTM-LC介導的表達無明顯區(qū)別。結(jié)論:密碼子優(yōu)化操作顯著改善了HPV16L1在畢赤酵母中的表達,但表達水平與密碼子利用優(yōu)劣并不完全對應(yīng),提示密碼子優(yōu)化僅是部分原因,而mRNA結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性變化值得探討。蛋白酶缺陷菌株提高了HPV16L1蛋白的穩(wěn)定性,顯著影響了表達水平。研究證明基因劑量對HPV16L1的表達未產(chǎn)生明顯影響。
[Abstract]:Objective: to optimize the expression of human papillomavirus 16 major capsid protein L1 (human papillomavirus type 16 major capsid protein L1 HPV16 L1 in Pichia pastoris and to investigate the possible influencing factors. Methods: four HPV16L1 genes, M16, Y16, P16 and W16, with different sequence characteristics, were optimized for mammalian cell codon optimization according to yeast codon. W16 was cloned into Pichia pastoris expression plasmids p PinkTM-HC (high gene copy colony screening) and p PinkTM-LC (low gene copy colony screening), respectively, and transformed into different protease deficient host bacteria. After methanol induction for 24 hours, the expression of L1 protein was analyzed by Western blot. Results: M16 showed the highest level of expression, followed by Y16 and P16, while W16 showed little expression. The codon adaptation index of the four genes was Y16M16W16 and P16s respectively from high to low. By free energy and GC analysis, the secondary structure of mRNA was -409.40 kcal/mol and 43.85m16 was -451.50 kcal/mol and 47.83 kcal/mol, respectively, and P16 was -606.50 kcal / mol and 64.10% W16 was -384.70 kcal/mol and 38.01. The expression of protease deficient strain L1 was higher than that of wild-type strain. There was no significant difference between plasmid p PinkTM-HC and p PinkTM-LC mediated expression. Conclusion: codon optimization can significantly improve the expression of HPV16L1 in Pichia pastoris, but the expression level is not exactly corresponding to the use of codon, suggesting that the codon optimization is only part of the reason, and the change of mRNA structure and stability is worth discussing. Protease deficient strains increased the stability of HPV16L1 protein and significantly affected the expression level. The results showed that the gene dose had no significant effect on the expression of HPV16L1.
【作者單位】： 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所;云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室;云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心;云南省重大傳染病疫苗研發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心;
【基金】：云南省科技計劃重點項目(2016FA049) 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項目(2010ZC232) 中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費(2012N08)資助項目
【分類號】：R373

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本文編號：2196343