【摘要】：目的:優(yōu)化人乳頭瘤病毒16型主要衣殼蛋白L1(human papillomavirus type 16 major capsid protein L1,HPV16L1)在畢赤酵母中的表達(dá),并考察可能的影響因素。方法:四個不同序列特征的HPV16L1基因M16、Y16、P16、W16(其中,M16和Y16按酵母密碼子優(yōu)化,P16為哺乳動物細(xì)胞密碼子優(yōu)化,而W16為野生型序列)分別克隆于畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒p PinkTM-HC(高基因拷貝菌落篩選)和p PinkTM-LC(低基因拷貝菌落篩選),并轉(zhuǎn)化不同蛋白酶缺陷的宿主菌。甲醇誘導(dǎo)24小時后,取菌體樣品經(jīng)Western blot分析L1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:M16顯示了最高的表達(dá)水平,其次是Y16與P16,而W16幾乎無表達(dá)�；蛐蛄忻艽a子應(yīng)用特征分析顯示,4個基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)從高到低依次為Y16、M16、W16和P16。通過自由能和GC含量分析4個序列的mRNA二級結(jié)構(gòu),Y16為-409.40 kcal/mol和43.85%;M16為-451.50 kcal/mol和47.83%;P 16為-606.50kcal/mol and 64.10%;W16為-384.70 kcal/mol and 38.01%。蛋白酶缺陷菌株L1表達(dá)高于野生型菌株,質(zhì)粒p PinkTM-HC與p PinkTM-LC介導(dǎo)的表達(dá)無明顯區(qū)別。結(jié)論:密碼子優(yōu)化操作顯著改善了HPV16L1在畢赤酵母中的表達(dá),但表達(dá)水平與密碼子利用優(yōu)劣并不完全對應(yīng),提示密碼子優(yōu)化僅是部分原因,而mRNA結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性變化值得探討。蛋白酶缺陷菌株提高了HPV16L1蛋白的穩(wěn)定性,顯著影響了表達(dá)水平。研究證明基因劑量對HPV16L1的表達(dá)未產(chǎn)生明顯影響。
[Abstract]:Objective: to optimize the expression of human papillomavirus 16 major capsid protein L1 (human papillomavirus type 16 major capsid protein L1 HPV16 L1 in Pichia pastoris and to investigate the possible influencing factors. Methods: four HPV16L1 genes, M16, Y16, P16 and W16, with different sequence characteristics, were optimized for mammalian cell codon optimization according to yeast codon. W16 was cloned into Pichia pastoris expression plasmids p PinkTM-HC (high gene copy colony screening) and p PinkTM-LC (low gene copy colony screening), respectively, and transformed into different protease deficient host bacteria. After methanol induction for 24 hours, the expression of L1 protein was analyzed by Western blot. Results: M16 showed the highest level of expression, followed by Y16 and P16, while W16 showed little expression. The codon adaptation index of the four genes was Y16M16W16 and P16s respectively from high to low. By free energy and GC analysis, the secondary structure of mRNA was -409.40 kcal/mol and 43.85m16 was -451.50 kcal/mol and 47.83 kcal/mol, respectively, and P16 was -606.50 kcal / mol and 64.10% W16 was -384.70 kcal/mol and 38.01. The expression of protease deficient strain L1 was higher than that of wild-type strain. There was no significant difference between plasmid p PinkTM-HC and p PinkTM-LC mediated expression. Conclusion: codon optimization can significantly improve the expression of HPV16L1 in Pichia pastoris, but the expression level is not exactly corresponding to the use of codon, suggesting that the codon optimization is only part of the reason, and the change of mRNA structure and stability is worth discussing. Protease deficient strains increased the stability of HPV16L1 protein and significantly affected the expression level. The results showed that the gene dose had no significant effect on the expression of HPV16L1.
【作者單位】： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所;云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室;云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心;云南省重大傳染病疫苗研發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心;
【基金】：云南省科技計劃重點項目(2016FA049) 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項目(2010ZC232) 中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費(2012N08)資助項目
【分類號】：R373

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉志遠(yuǎn) ,許淑珍;人乳頭瘤病毒可導(dǎo)致哪些疾病?[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2003年03期

2 吳劍波;李新宇;鄭家潤;;人乳頭瘤病毒體外研究的技術(shù)及進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2005年06期

3 田甜;鄭玉巧;;我是間諜我怕誰——人乳頭瘤病毒的生存哲學(xué)[J];醫(yī)藥世界;2007年09期

4 熊思東;;人乳頭瘤病毒7型DNA的分子克隆及鑒定[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);1987年05期

5 舒t t ,馮慧敏,金奇,侯云德;我國人乳頭瘤病毒6型新變種基因組的克隆與鑒定[J];病毒學(xué)報;1991年03期

6 倉堯卿,朱若英;人乳頭瘤病毒及其疫苗的研究[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2000年04期

7 蔡萍;人乳頭瘤病毒16型對細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2002年05期

8 危敏;馬文麗;李凌;張寶;鄭文嶺;;人乳頭瘤病毒芯片寡核苷酸探針的研究[J];微生物學(xué)通報;2006年02期

9 孫媛媛;苗季;夏寧邵;;人乳頭瘤病毒結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中的作用研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報;2008年01期

10 張衛(wèi),司靜懿,李昆,陳連鳳,趙維敏,韓日才;人乳頭瘤病毒16型亞基因DNA體外轉(zhuǎn)化功能的細(xì)胞學(xué)研究[J];病毒學(xué)報;1991年03期

相關(guān)會議論文 前7條

1 田永強;張榮意;朱中元;;人乳頭瘤病毒線性平行雜交分型檢測條件的建立及優(yōu)化[A];2009年海南省微生物學(xué)檢測及質(zhì)量保證研討會論文集[C];2009年

2 魏蘭蘭;谷鴻喜;;16型人乳頭瘤病毒衣殼蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)[A];慶祝黑龍江省免疫學(xué)會成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

3 于俊閣;王文群;長曉楓;蔡洪斌;;原位雜交法檢測人乳頭瘤病毒DNA[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

4 朱珊麗;歐琴;王鵬飛;石朝輝;陳俊;張麗芳;;溫州地區(qū)人乳頭瘤病毒(HPV)6和11型結(jié)構(gòu)蛋白L1基因多態(tài)性及蛋白特性分析[A];2007年浙江省醫(yī)學(xué)病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

5 莊敏;谷鴻喜;李迪;魏蘭蘭;林道紅;凌虹;孔衛(wèi)蘭;;人乳頭瘤病毒16型和11型L1基因雙價重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[A];慶祝黑龍江省免疫學(xué)會成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

6 張魏芳;趙蔚明;于修平;;58型人乳頭瘤病毒早期蛋白E7對細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控作用研究[A];2012全國臨床微生物與感染免疫學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

7 段肖翠;靳霞;劉靜;王曉燕;呂占軍;;L1不同片段正、反序列影響基因表達(dá)研究[A];遺傳學(xué)進(jìn)步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 歷鵬;TREX1通過ORF1p降解途徑抑制L1逆轉(zhuǎn)錄因子活性并保護(hù)基因組完整性的研究[D];吉林大學(xué);2017年

2 趙蔚明;低危型人乳頭瘤病毒優(yōu)化密碼E7基因的研究[D];山東大學(xué);2004年

3 謝喜秀;以人乳頭瘤病毒（HPV）病毒樣顆粒（VLP）為基礎(chǔ)的預(yù)防性疫苗的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

4 王鑫;人乳頭瘤病毒58型（HPV58）E2蛋白與E7蛋白的直接相互作用及效果研究[D];山東大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉玉雪;人乳頭瘤病毒早期E6蛋白的識別檢測及晚期L1蛋白的組裝調(diào)控研究[D];吉林大學(xué);2017年

2 周支香;環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型及人乳頭瘤病毒6型和11型的實驗研究[D];南華大學(xué);2010年

3 郭森;人乳頭瘤病毒快速分型的目視化基因芯片技術(shù)研究及應(yīng)用[D];西北大學(xué);2010年

4 李菁菁;人乳頭瘤病毒16型E2基因的克隆、表達(dá)及鑒定[D];新疆大學(xué);2008年

5 孟鳳麗;人乳頭瘤病毒33亞型L1蛋白的重組表達(dá)及免疫原性鑒定[D];鄭州大學(xué);2017年

6 計雄飛;人乳頭瘤病毒6b型L1基因的克隆及真核表達(dá)[D];暨南大學(xué);2006年

7 杜燕華;人乳頭瘤病毒液態(tài)懸浮芯片基因分型方法的建立及臨床應(yīng)用的初步研究[D];西北大學(xué);2006年

8 佟惠春;人乳頭瘤病毒11型L1基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

9 劉斌;人乳頭瘤病毒6型L1的克隆表達(dá)與純化[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

10 耿星濤;人乳頭瘤病毒58型晚期蛋白L1在大腸桿菌中的表達(dá)及純化的研究[D];吉林大學(xué);2006年

，

本文編號：2196343