發(fā)布時間：2018-08-17 11:40

【摘要】：目的探索并固定大鼠脂肪干細胞獲得、增殖和傳代的方法和操作流程，并且通過誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為成脂細胞、成骨細胞而證明脂肪干細胞的多向分化能力。 方法取質(zhì)量約120克的SD大鼠2只，性別不限，分離其腹股溝脂肪組織，將其剪碎并用濾網(wǎng)過濾，然后經(jīng)一系列操作而將含有脂肪干細胞的培養(yǎng)液平鋪于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并進而增殖、傳代。之后，通過細胞流式分析檢測第三代細胞表型證明其為脂肪干細胞。之后分別更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨細胞培養(yǎng)基，誘導(dǎo)脂肪干細胞定向分化為脂肪細胞和骨細胞。 結(jié)果成功分離培養(yǎng)出脂肪干細胞，并能進行增殖和傳代。利用流式細胞技術(shù)檢測脂肪干細胞的CD34(+)、CD44（+）、CD45(-)、CD106（+），證明該細胞為脂肪干細胞。而向脂肪和成骨細胞誘導(dǎo)的細胞均發(fā)生了明顯變化，最后分別通過油紅O染色和堿性磷酸酶試劑盒證明脂肪干細胞分化為脂肪細胞和成骨細胞。 結(jié)論脂肪組織中存在脂肪干細胞，并能夠成功的分離、增殖和傳代。并且擁有多向分化能力。可以成功的誘導(dǎo)分化為脂肪細胞和成骨細胞。 目的：使用神經(jīng)細胞誘導(dǎo)液將脂肪間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細胞。 方法：首先是將第三代脂肪間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁達到80%以上時消化，然后使其重新貼壁于六孔板中，細胞數(shù)量約為105級。然后用添加了bFGF和EGF以及B27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)六孔板中的細胞。每3天半量添加新的培養(yǎng)液，至5-7天左右就可以看到細胞增殖形成培養(yǎng)液中懸浮的細胞球。取誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天的細胞球進行nestin的免疫熒光染色。最后，將培養(yǎng)好的細胞球吹散，離心，并將之培養(yǎng)在僅添加了B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化10天，然后再進行NeuN、GFAP和β-tubulin熒光染色來鑒定分化成的細胞。 結(jié)果：在使用了含有bFGF和EGF以及B27的Neurobasal培養(yǎng)基誘導(dǎo)了5天時就出現(xiàn)了懸浮的細胞球，并且通過免疫熒光染色證明為nestin陽性，證明其為神經(jīng)干細胞的細胞球。而在使用了僅添加了B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化10天后，打散的細胞球細胞也分化成了神經(jīng)細胞，并經(jīng)過了MAP2ab、NeuN、GFAP和β-tubulin熒光染色鑒定，證明分化成了神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。 結(jié)論：經(jīng)特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，，脂肪間充質(zhì)干細胞可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細胞并且進一步分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。
[Abstract]:Objective to explore and immobilize the methods and procedures of obtaining, proliferating and passaging adipose stem cells in rats, and to prove the ability of adipose stem cells to differentiate into adipocytes and osteoblasts by inducing adipose stem cells to differentiate into adipogenic cells and osteoblasts. Methods two SD rats of about 120g mass, with unlimited sex, were isolated from their inguinal adipose tissue, then shredded and filtered by filter, and then cultured in 25cm2 culture flask with a series of culture medium containing adipose stem cells. And then proliferate, subculture. After that, the third generation cells were identified as adipose stem cells by flow cytometry. Then the adipogenic medium and osteoblast medium were changed to induce adipocytes to differentiate into adipocytes and osteoblasts. Results Adipose stem cells were successfully isolated and cultured, and could be proliferated and subcultured. CD34 () CD44 (-) CD45 (-) CD106 (), of adipose stem cells was detected by flow cytometry. The differentiation of adipocytes into adipocytes and osteoblasts was proved by oil red O staining and alkaline phosphatase kit. Conclusion adipose stem cells exist in adipose tissue and can be successfully isolated, proliferated and subcultured. And has the ability to differentiate in multiple directions. Adipocytes and osteoblasts can be successfully induced to differentiate into adipocytes and osteoblasts. Aim: to differentiate adipose mesenchymal stem cells into neuronal like cells by neuronal induction. Methods: first, the third generation adipose mesenchymal stem cells were digested when the adherent reached 80% in the culture bottle, and then the cells were reattached to the six-hole plate. The number of cells was about 105 grade. Then the cells in the six-well plate were cultured on Neurobasal medium supplemented with bFGF and EGF and B 27. After adding the new medium every 3 and a half days, the cell proliferation can be seen in the culture medium from 5 to 7 days, and the cell ball suspended in the culture medium can be seen. The cells were cultured on the 7th day after induction for nestin immunofluorescence staining. Finally, the cultured cells were blown out, centrifuged, and cultured in Neurobasal medium supplemented with only B27 for 10 days, then the differentiated cells were identified by Neun GFAP and 尾 -tubulin fluorescence staining. Results: after 5 days of induction with Neurobasal medium containing bFGF, EGF and B27, suspended cell spheres were found, and were proved to be nestin positive by immunofluorescence staining, which were proved to be neural stem cells. On the other hand, after 10 days of differentiation induced by Neurobasal medium supplemented with only B27, the dispersed cells were also differentiated into neurons, and identified by MAP2ababa NeuNu GFAP and 尾 -tubulin fluorescence staining, it was proved that the cells were differentiated into neurons and astrocytes. Conclusion: adipose mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into neural stem cells and further differentiate into neurons and glial cells.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2

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本文編號：2187521