發(fā)布時間：2018-08-16 10:33

【摘要】：第一部分鼻飼熱休克蛋白60對動脈粥樣硬化形成及進展的影響 目的：研究HSP60經(jīng)鼻給藥后對動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展的影響,為臨床應用抗原誘導免疫耐受治療慢性炎性免疫性疾病提供依據(jù)。 方法：將6周齡的ApoE-/-雄性小鼠隨機分為HSP60組和PBS組,HSP60組與PBS組再分別隨機分為7周齡給藥組(早期組)和16周齡給藥組(晚期組)。HSP60組ApoE-/-小鼠經(jīng)鼻給予HSP60,對照組經(jīng)鼻給予PBS,在16周齡或24周齡時,冰凍切片后,用HE和油紅O染色法觀察處理組和對照組小鼠主動脈根部粥樣斑塊的面積大小,比較兩者之間是否有統(tǒng)計學差異。 結果：對于7周齡時給藥的ApoE-/-小鼠,在16周齡時,HSP60組小鼠較PBS對照組小鼠其主動脈根部斑塊面積明顯減少,達53.7%之多(226432±29676μm2vs489250±31339μm2;P0.01)。而對于10周齡時給藥ApoE-/-小鼠,在24周齡時,HSP60組小鼠與PBS對照組小鼠主動脈根部粥樣斑塊面積無顯著統(tǒng)計學差異(845917士61180μm2vs800685±39654μm2；P0.05)。 結論：經(jīng)鼻給予HSP60可降低ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的形成,而對動脈粥樣硬化的進展似乎沒有明顯抑制作用,且短暫給予HSP60后能保持長期的動脈粥樣硬化抑制效果(至少10周),為臨床上提供了一種潛在的動脈粥樣硬化治療方法。 第二部分鼻飼熱休克蛋白60抑制動脈粥樣硬化的潛在機制 目的：研究經(jīng)鼻給予HSP60誘導免疫耐受減少動脈粥樣硬化形成的機制,探討Treg細胞及細胞因子TGF-β在免疫耐受誘導中的作用。 方法：6周齡ApoE-/-雄性小鼠高質飲食一周后經(jīng)鼻給予HSP60或PBS作為對照,鼻飼后第4天和第14天,應用流式細胞學技術檢測ApoE-/-小鼠頸部淋巴結(CLNs)和脾臟中CD4+LAP+和CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的數(shù)量及組成比例；ELISA被用于鼻飼后第4天、第14天和第8周細胞因子TGF-β及NF-γ等水平的測定；鼻飼后8周,用Real-time PCR實驗方法測定ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內TGF-β、INF-γ、CD25、 Foxp3、MCP-1等細胞因子的水平。 結果：流式細胞學發(fā)現(xiàn)鼻飼后4天,小鼠脾臟和CLNs中CD4+CD25+LAP+T細胞占所有CD4+T細胞的百分比在HSP60與PBS兩組間沒有顯著差異,但是,鼻飼后14天,我們觀察到HSP60處理組小鼠脾臟和CLNs中CD4+CD25-LAP+T細胞占所有CD4+T細胞的百分比較PBS處理組小鼠有明顯升高(P＜0.01)；ELISA發(fā)現(xiàn)鼻飼后4天,14天和8周三個時間點,HSP60組小鼠CLNs的TGF-β水平較PBS組都有明顯升高(P0.01),鼻飼后8周INF-γ水平HSP60處理組小鼠較PBS處理組小鼠有顯著性降低(P0.05):Real-time PCR發(fā)現(xiàn)HSP60處理組兩種炎性標志物MCP-1和INF-γ的表達較對照組有明顯降低(P0.05),對于Treg細胞特異性標志物TGF-β,其相對mRNA表達水平在鼻飼HSP60組比PBS組有顯著性升高(P0.05)。 結論：鼻飼HSP60致動脈粥樣硬化形成減輕可能與誘導Treg細胞生成有關,尤其是CD4+CD25-LAP+T細胞,且這一有益作用的潛在機制也許和Treg細胞分泌的細胞因子TGF-β關系密切。
[Abstract]:Part I effects of nasal feeding of heat shock protein 60 on the formation and progression of atherosclerosis objective: to study the effect of HSP60 on the formation and development of atherosclerosis after nasal administration. To provide evidence for clinical application of antigen-induced immune tolerance in the treatment of chronic inflammatory immune diseases. Methods: six week-old ApoE-r-male mice were randomly divided into HSP60 group, PBS group, HSP60 group and PBS group. They were randomly divided into 7-week-old group (early group) and 16-week-old group (late group). HSP60 group was given intranasal administration of HSP60, and the control group was treated with HSP60. Nasal administration of PBSs at 16 or 24 weeks of age, After frozen sections, HE and oil red O staining were used to observe the size of atherosclerotic plaques in the root of aorta of the treated and control mice, and to compare whether there were statistical differences between the two groups. Results: the aortic root plaque area in HSP60 group was significantly decreased to 53.7% (226432 鹵29676 渭 m2vs489250 鹵31339 渭 m 2P0.01) compared with that in PBS control group at the age of 16 weeks (226432 鹵29676 渭 m2vs489250 鹵31339 渭 m ~ (2) P 0.01). However, there was no significant difference in the area of aortic root atherosclerotic plaque between HSP60 group and PBS control group at 24 weeks of age (845917 鹵61180 渭 m2vs800685 鹵39654 渭 m ~ (-2) P 0.05). Conclusion: nasal administration of HSP60 can reduce the formation of atherosclerosis in ApoE-r-mice, but it does not seem to inhibit the progression of atherosclerosis. Short administration of HSP60 can maintain long-term atherosclerotic inhibition (at least 10 weeks), which provides a potential therapy for atherosclerosis. Part two the potential mechanism of heat shock protein 60 (HSP60) in inhibiting atherosclerosis by nasal feeding objective: to study the mechanism of immune tolerance induced by nasal administration of HSP60 to reduce the formation of atherosclerosis. To investigate the role of Treg cells and cytokine TGF- 尾 in the induction of immune tolerance. Methods after a week of high quality diet, HSP60 or PBS were given to the male mice at the age of 6 weeks as control, and on the 4th and 14th days after nasal feeding, the mice were treated with HSP60 or PBS. The number and proportion of CD4 LAP and CD4 CD25 Foxp3 Treg cells in cervical lymph nodes and spleen of ApoE-r-mice were detected by flow cytometry. The levels of cytokines TGF- 尾 and NF- 緯 were determined by Elisa on the 4th, 14th and 8th week after nasal feeding. At 8 weeks after nasal feeding, the levels of cytokines such as TGF- 尾 -INF- 緯 CD25, Foxp3 and MCP-1 in aortic plaques of ApoE-r-mice were measured by Real-time PCR assay. Results: on day 4 after nasal feeding, the percentage of CD4 CD25 LAP T cells in spleen and CLNs in all CD4 T cells was not significantly different between HSP60 and PBS groups. However, 14 days after nasal feeding, there was no significant difference in the percentage of CD4 CD25 LAP T cells between HSP60 and PBS groups. We observed that the percentage of CD4 CD25-LAP T cells in spleen and CLNs of HSP60 treated mice was significantly higher than that of PBS treated mice (P < 0. 01). ELISA found that the level of TGF- 尾 in HSP60 group was significantly higher than that in PBS group at 14 days and 8 weeks after nasal feeding (P0.01), and the level of INF- 緯 in HSP60 group was significantly lower than that in PBS group at 8 weeks after nasal feeding (P0.05). Compared with the control group, the expression of MCP-1 and INF- 緯 in the two inflammatory markers were significantly decreased (P0.05). For TGF- 尾, the relative mRNA expression level in the HSP60 group was significantly higher than that in the PBS group (P0.05). Conclusion: the reduction of atherosclerosis induced by nasal feeding of HSP60 may be related to the induction of Treg cells, especially CD4 CD25-LAP T cells, and the potential mechanism of this beneficial effect may be closely related to the cytokine TGF- 尾 secreted by Treg cells.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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