【摘要】：目的：構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-Ag85B,通過酶切鑒定和測(cè)序鑒定后在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),并用Western-blot檢測(cè)表達(dá)結(jié)果,為開發(fā)新型的結(jié)核病疫苗和結(jié)核病血清免疫診斷試劑奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)GenBank上結(jié)核分枝桿菌Ag85B基因的CDS序列,應(yīng)用primer premier5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物,分別在引物5’端引入Nhe I和EcoR I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。從結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv中提取基因組DNA,應(yīng)用引物,擴(kuò)增Ag85B基因片段,用PCR回收試劑盒割膠回收后純化PCR產(chǎn)物,雙酶切PCR產(chǎn)物及真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES,經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用氨芐青霉素篩選陽性克隆后,再經(jīng)PCR,雙酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將重組質(zhì)粒PIRES-Ag85B轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,48小時(shí)后用G418進(jìn)行篩選,并用Western blot檢測(cè)Ag85B的基因表達(dá)。 結(jié)果：從結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA中擴(kuò)增出978bp的Ag85B基因,并成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-Ag85B,經(jīng)Nhe I和EcoR I雙酶切后電泳獲得61,000bp和978bp的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,經(jīng)測(cè)序證實(shí)獲得目的基因序列與GenBank公布的一致,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后獲得穩(wěn)定表達(dá)Ag85B的CHO細(xì)胞株,用Western blot方法在蛋白水平檢測(cè)Ag85B的基因表達(dá)。 結(jié)論：1從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增出Ag85B基因片段并成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-Ag85B。2 Ag85B目基因在CHO細(xì)胞中獲得表達(dá)。 圖：14表：1參：49
[Abstract]:Objective: to construct the eukaryotic expression plasmid PIRES-Ag85B and express it in CHO cells by restriction endonuclease digestion and sequencing, and to establish the foundation for the development of new TB vaccine and tuberculosis serum immunological diagnostic reagent. Methods: according to the CDS sequence of Ag85B gene of Mycobacterium tuberculosis on GenBank, primer premier5.0 was used to design a pair of primers. Nhe I and EcoR I restriction sites and protective bases were introduced into the 5 'end of the primers, respectively. Genomic DNA was extracted from the standard strain of Mycobacterium tuberculosis (H37Rv). The Ag85B gene fragment was amplified by primers, and the PCR product was purified by PCR recovery kit. The PCR products and eukaryotic expression plasmid PIRESwere digested by double enzyme, and then transformed into DH5 偽 competent cells by T4DNA ligase. The positive clones were screened by ampicillin, then identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid PIRES-Ag85B was transfected into CHO cells for 48 hours by liposome transfection and then screened by G418. The gene expression of Ag85B was detected by Western blot. Results: the Ag85B gene of 978bp was amplified from the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv, and the eukaryotic expression plasmid PIRES-Ag85B was successfully constructed. The bands of 61000bp and 978bp were obtained by Nhe I and EcoR I double enzyme digestion electrophoresis. It was confirmed by sequencing that the sequence of the target gene was consistent with that published by GenBank. After transfection into CHO cells, stable CHO cell lines expressing Ag85B were obtained. Western blot method was used to detect the expression of Ag85B gene at the protein level. Conclusion the Ag85B gene fragment was amplified from the H37Rv genome of Mycobacterium tuberculosis and the eukaryotic expression plasmid PIRES-Ag85B.2 Ag85B order gene was successfully constructed and expressed in CHO cells. Fig. 14 Table 1 refs: 49
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.9

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本文編號(hào)：2184655