【摘要】：結核病(Tuberculosis, TB)是一種由結核分枝桿菌(Mycobactium tuberculosis，簡稱結核桿菌)感染引起的人畜共患慢性傳染病，仍然是當今威脅人類健康的最主要疾病之一。結核病的傳統(tǒng)診斷方法易受多種因素的干擾而產(chǎn)生較高的假陽性或假陰性結果，不利于結核病的早期確診與治療，因此，發(fā)展新穎有效、靈敏度高和特異性強的診斷技術非常必要。盡管不少結核桿菌抗原已經(jīng)被鑒定，但是其中大多數(shù)不適合應用于鑒別診斷卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）免疫接種的健康人群與真正的結核病患者。結核桿菌基因組約10%序列用于編碼PE（theproteins which contain Pro-Glu (PE) motif）和PPE（the proteins which containPro-Pro-Glu (PPE) motif）蛋白家族，且該家族蛋白為結核桿菌所特有。目前已有一些關于PPE蛋白家族成員已被成功鑒定并加以應用，但較為系統(tǒng)地分析PPE蛋白免疫原性的報道尚不多見。 本研究應用系統(tǒng)進化分析法選取10個PPE蛋白家族成員作為研究對象，PCR擴增PPE蛋白編碼基因后克隆至pET32a或pET41a質(zhì)粒中構建重組PPE蛋白表達載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3）并篩選陽性表達菌株。重組表達的PPE融合蛋白用金屬螯合鎳離子柱親和層析分離純化，純化的重組PPE融合蛋白作為目標抗原分別包被96孔酶標板，建立標準的ELISA為基礎的血清學檢查方法，用于結核病的早期診斷。60例臨床確診的結核病人和30例健康人的血清被用作ELISA檢測，所得OD值經(jīng)SPSS17.0軟件分析制作ROC曲線，通過ROC曲線來計算ELISA靈敏度和特異性，并進一步評估各個PPE抗原用作早期血清學診斷的價值。 本研究在大腸桿菌中克隆、表達了10個選擇的PPE抗原，然而PPE68未能純化成功。以純化的PPE蛋白作為包被抗原建立了ELISA血清學診斷方法，結果發(fā)現(xiàn)所有以PPE蛋白作為抗原的ELISA檢測靈敏度均比Ag85A（antigen85A）高。Ag85A抗原的ROC曲線下面積僅0.573，而所有PPE蛋白ROC曲線下面積均大于0.679，說明PPE蛋白作為抗原的血清學診斷的準確性更高。這是因為Ag85A不僅存在于結核桿菌中，，也存在于BCG等其他分枝桿菌中，易引起交叉反應，因而特異性不高。在選擇的五類PPE抗原中，第一類PPE蛋白（PPE68）未能成功純化；第二類PPE蛋白（PPE37）檢測的特異性最高（99.3%），僅次于結核桿菌特異性抗原ESAT-6（early secretory antigenic target-6），但其檢測靈敏度（65%）和準確性（ROC曲線下面積0.738）均比ESAT-6高，且國內(nèi)外未見有報道，提示其可作為一種新型的候選抗原應用于結核病的早期血清學診斷研究；第三類PPE蛋白（PPE36、PPE41、PPE57、 PPE58、PPE59、PPE69）的檢測靈敏度（65%~80%）和準確度（ROC曲線下面積0.761~0.805）均要高于PPE37，然而其特異性略低（80%~93.3%），與相關文獻報道的結果一致；第四類PPE蛋白（PPE17）的檢測靈敏度（63.3%）、特異性（83.3%）和準確性（ROC曲線下面積0.679）均不高；第五類PPE蛋白（PPE64）的檢測靈敏度（63.3%）、特異性（90%）和準確性（ROC曲線下面積0.757）與PPE37相近，提示其也可以作為新型血清學診斷的候選抗原之一。 本研究成功克隆、表達并純化了9個PPE抗原，應用ELISA方法初步驗證了PPE抗原的良好免疫原性，第二類PPE抗原PPE37和第五類PPE抗原PPE64的檢測靈敏度、特異性和準確性都要明顯優(yōu)于ESAT-6，且目前國內(nèi)外尚未有相關研究報道，提示這兩種PPE蛋白可作為血清學診斷的候選抗原。我們還將進一步應用這些純化的PPE抗原刺激結核病人的外周血單核細胞并分析其引起的細胞免疫反應，綜合評價PPE抗原的免疫原性并探討其在結核病診斷或疫苗研究中的意義。
[Abstract]:Tuberculosis (TB) is a chronic zoonotic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) infection. It is still one of the most important diseases threatening human health. Traditional diagnostic methods of tuberculosis are susceptible to interference from many factors and produce high false positive or false negative results. As a result, it is not conducive to the early diagnosis and treatment of tuberculosis. Therefore, it is necessary to develop novel, effective, sensitive and specific diagnostic techniques. True tuberculosis patients. About 10% of the genome of Mycobacterium tuberculosis is used to encode PE (the proteins which contain Pro-Glu (PE) motif) and the PPE (the proteins which contain Pro-Pro-Glu (PPE) motif) protein family, and the family proteins are unique to Mycobacterium tuberculosis. However, a systematic analysis of the immunogenicity of PPE protein is rare.
In this study, 10 members of PPE protein family were selected as the research object by phylogenetic analysis. The PPE protein coding gene was amplified by PCR and cloned into pET32a or pET41a plasmid to construct recombinant PPE protein expression vector. The recombinant PPE fusion protein was transformed into E. coli BL21 (DE3) and the positive expression strain was screened. The purified recombinant PPE fusion protein was separated and purified by affinity chromatography and coated with 96-well enzyme plate as the target antigen. A standard ELISA-based serological method was established for the early diagnosis of tuberculosis. The sera of 60 clinically confirmed tuberculosis patients and 30 healthy persons were used for ELISA detection. The OD values were analyzed by SPSS17.0 software. ROC curves were made to calculate the sensitivity and specificity of ELISA, and to further evaluate the value of each PPE antigen for early serological diagnosis.
In this study, 10 selected PPE antigens were cloned and expressed in E. coli. However, PPE68 was not purified successfully. ELISA was established by using purified PPE protein as coating antigen. The results showed that the sensitivity of ELISA using PPE protein as antigen was higher than that of Ag85A. The area under ROC curve of Ag85A antigen was only small. The area under the ROC curve of all PPE proteins was greater than 0.679, indicating that the serological diagnostic accuracy of PPE proteins as antigens was higher. This is because Ag85A not only exists in Mycobacterium tuberculosis, but also exists in other Mycobacterium such as BCG. It is easy to cause cross-reaction and therefore has low specificity. White (PPE68) was not purified successfully; the specificity of PPE37 was the highest (99.3%) after ESAT-6 (early secretory antigenic target-6), but its sensitivity (65%) and accuracy (ROC area 0.738) were higher than that of ESAT-6, and it was not reported at home and abroad, suggesting that PPE37 could be used as a specific antigen of Mycobacterium tuberculosis. The sensitivity (65%-80%) and accuracy (ROC curve area 0.761-0.805) of the third class of PPE proteins (PPE36, PPE41, PPE57, PPE58, PPE59, PPE69) were higher than those of PPE37, but their specificity was slightly lower (80%-93.3%) and were consistent with the results reported in the relevant literature. The detection sensitivity (63.3%) of PPE-like protein (PPE17), specificity (83.3%) and accuracy (0.679 under ROC curve) were not high; the detection sensitivity (63.3%) of PPE-like protein (PPE64), specificity (90%) and accuracy (0.757 under ROC curve) were similar to PPE-37, suggesting that PPE-like protein could also be used as a candidate antigen for new serological diagnosis.
Nine PPE antigens were successfully cloned, expressed and purified in this study. The immunogenicity of PPE antigens was preliminarily verified by ELISA. The sensitivity, specificity and accuracy of PPE37 and PPE64 of the second and fifth PPE antigens were significantly better than those of ESAT-6, and there were no reports on these two kinds of PPE eggs at home and abroad. We will further apply these purified PPE antigens to stimulate peripheral blood mononuclear cells of tuberculosis patients and analyze their cellular immune responses, evaluate the immunogenicity of PPE antigens and explore their significance in tuberculosis diagnosis or vaccine research.
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

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本文編號：2183021