【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobactium tuberculosis，簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌)感染引起的人畜共患慢性傳染病，仍然是當(dāng)今威脅人類健康的最主要疾病之一。結(jié)核病的傳統(tǒng)診斷方法易受多種因素的干擾而產(chǎn)生較高的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，不利于結(jié)核病的早期確診與治療，因此，發(fā)展新穎有效、靈敏度高和特異性強(qiáng)的診斷技術(shù)非常必要。盡管不少結(jié)核桿菌抗原已經(jīng)被鑒定，但是其中大多數(shù)不適合應(yīng)用于鑒別診斷卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）免疫接種的健康人群與真正的結(jié)核病患者。結(jié)核桿菌基因組約10%序列用于編碼PE（theproteins which contain Pro-Glu (PE) motif）和PPE（the proteins which containPro-Pro-Glu (PPE) motif）蛋白家族，且該家族蛋白為結(jié)核桿菌所特有。目前已有一些關(guān)于PPE蛋白家族成員已被成功鑒定并加以應(yīng)用，但較為系統(tǒng)地分析PPE蛋白免疫原性的報(bào)道尚不多見(jiàn)。 本研究應(yīng)用系統(tǒng)進(jìn)化分析法選取10個(gè)PPE蛋白家族成員作為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增PPE蛋白編碼基因后克隆至pET32a或pET41a質(zhì)粒中構(gòu)建重組PPE蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）并篩選陽(yáng)性表達(dá)菌株。重組表達(dá)的PPE融合蛋白用金屬螯合鎳離子柱親和層析分離純化，純化的重組PPE融合蛋白作為目標(biāo)抗原分別包被96孔酶標(biāo)板，建立標(biāo)準(zhǔn)的ELISA為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢查方法，用于結(jié)核病的早期診斷。60例臨床確診的結(jié)核病人和30例健康人的血清被用作ELISA檢測(cè)，所得OD值經(jīng)SPSS17.0軟件分析制作ROC曲線，通過(guò)ROC曲線來(lái)計(jì)算ELISA靈敏度和特異性，并進(jìn)一步評(píng)估各個(gè)PPE抗原用作早期血清學(xué)診斷的價(jià)值。 本研究在大腸桿菌中克隆、表達(dá)了10個(gè)選擇的PPE抗原，然而PPE68未能純化成功。以純化的PPE蛋白作為包被抗原建立了ELISA血清學(xué)診斷方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有以PPE蛋白作為抗原的ELISA檢測(cè)靈敏度均比Ag85A（antigen85A）高。Ag85A抗原的ROC曲線下面積僅0.573，而所有PPE蛋白R(shí)OC曲線下面積均大于0.679，說(shuō)明PPE蛋白作為抗原的血清學(xué)診斷的準(zhǔn)確性更高。這是因?yàn)锳g85A不僅存在于結(jié)核桿菌中，，也存在于BCG等其他分枝桿菌中，易引起交叉反應(yīng)，因而特異性不高。在選擇的五類PPE抗原中，第一類PPE蛋白（PPE68）未能成功純化；第二類PPE蛋白（PPE37）檢測(cè)的特異性最高（99.3%），僅次于結(jié)核桿菌特異性抗原ESAT-6（early secretory antigenic target-6），但其檢測(cè)靈敏度（65%）和準(zhǔn)確性（ROC曲線下面積0.738）均比ESAT-6高，且國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有報(bào)道，提示其可作為一種新型的候選抗原應(yīng)用于結(jié)核病的早期血清學(xué)診斷研究；第三類PPE蛋白（PPE36、PPE41、PPE57、 PPE58、PPE59、PPE69）的檢測(cè)靈敏度（65%~80%）和準(zhǔn)確度（ROC曲線下面積0.761~0.805）均要高于PPE37，然而其特異性略低（80%~93.3%），與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致；第四類PPE蛋白（PPE17）的檢測(cè)靈敏度（63.3%）、特異性（83.3%）和準(zhǔn)確性（ROC曲線下面積0.679）均不高；第五類PPE蛋白（PPE64）的檢測(cè)靈敏度（63.3%）、特異性（90%）和準(zhǔn)確性（ROC曲線下面積0.757）與PPE37相近，提示其也可以作為新型血清學(xué)診斷的候選抗原之一。 本研究成功克隆、表達(dá)并純化了9個(gè)PPE抗原，應(yīng)用ELISA方法初步驗(yàn)證了PPE抗原的良好免疫原性，第二類PPE抗原PPE37和第五類PPE抗原PPE64的檢測(cè)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性都要明顯優(yōu)于ESAT-6，且目前國(guó)內(nèi)外尚未有相關(guān)研究報(bào)道，提示這兩種PPE蛋白可作為血清學(xué)診斷的候選抗原。我們還將進(jìn)一步應(yīng)用這些純化的PPE抗原刺激結(jié)核病人的外周血單核細(xì)胞并分析其引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)，綜合評(píng)價(jià)PPE抗原的免疫原性并探討其在結(jié)核病診斷或疫苗研究中的意義。
[Abstract]:Tuberculosis (TB) is a chronic zoonotic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) infection. It is still one of the most important diseases threatening human health. Traditional diagnostic methods of tuberculosis are susceptible to interference from many factors and produce high false positive or false negative results. As a result, it is not conducive to the early diagnosis and treatment of tuberculosis. Therefore, it is necessary to develop novel, effective, sensitive and specific diagnostic techniques. True tuberculosis patients. About 10% of the genome of Mycobacterium tuberculosis is used to encode PE (the proteins which contain Pro-Glu (PE) motif) and the PPE (the proteins which contain Pro-Pro-Glu (PPE) motif) protein family, and the family proteins are unique to Mycobacterium tuberculosis. However, a systematic analysis of the immunogenicity of PPE protein is rare.
In this study, 10 members of PPE protein family were selected as the research object by phylogenetic analysis. The PPE protein coding gene was amplified by PCR and cloned into pET32a or pET41a plasmid to construct recombinant PPE protein expression vector. The recombinant PPE fusion protein was transformed into E. coli BL21 (DE3) and the positive expression strain was screened. The purified recombinant PPE fusion protein was separated and purified by affinity chromatography and coated with 96-well enzyme plate as the target antigen. A standard ELISA-based serological method was established for the early diagnosis of tuberculosis. The sera of 60 clinically confirmed tuberculosis patients and 30 healthy persons were used for ELISA detection. The OD values were analyzed by SPSS17.0 software. ROC curves were made to calculate the sensitivity and specificity of ELISA, and to further evaluate the value of each PPE antigen for early serological diagnosis.
In this study, 10 selected PPE antigens were cloned and expressed in E. coli. However, PPE68 was not purified successfully. ELISA was established by using purified PPE protein as coating antigen. The results showed that the sensitivity of ELISA using PPE protein as antigen was higher than that of Ag85A. The area under ROC curve of Ag85A antigen was only small. The area under the ROC curve of all PPE proteins was greater than 0.679, indicating that the serological diagnostic accuracy of PPE proteins as antigens was higher. This is because Ag85A not only exists in Mycobacterium tuberculosis, but also exists in other Mycobacterium such as BCG. It is easy to cause cross-reaction and therefore has low specificity. White (PPE68) was not purified successfully; the specificity of PPE37 was the highest (99.3%) after ESAT-6 (early secretory antigenic target-6), but its sensitivity (65%) and accuracy (ROC area 0.738) were higher than that of ESAT-6, and it was not reported at home and abroad, suggesting that PPE37 could be used as a specific antigen of Mycobacterium tuberculosis. The sensitivity (65%-80%) and accuracy (ROC curve area 0.761-0.805) of the third class of PPE proteins (PPE36, PPE41, PPE57, PPE58, PPE59, PPE69) were higher than those of PPE37, but their specificity was slightly lower (80%-93.3%) and were consistent with the results reported in the relevant literature. The detection sensitivity (63.3%) of PPE-like protein (PPE17), specificity (83.3%) and accuracy (0.679 under ROC curve) were not high; the detection sensitivity (63.3%) of PPE-like protein (PPE64), specificity (90%) and accuracy (0.757 under ROC curve) were similar to PPE-37, suggesting that PPE-like protein could also be used as a candidate antigen for new serological diagnosis.
Nine PPE antigens were successfully cloned, expressed and purified in this study. The immunogenicity of PPE antigens was preliminarily verified by ELISA. The sensitivity, specificity and accuracy of PPE37 and PPE64 of the second and fifth PPE antigens were significantly better than those of ESAT-6, and there were no reports on these two kinds of PPE eggs at home and abroad. We will further apply these purified PPE antigens to stimulate peripheral blood mononuclear cells of tuberculosis patients and analyze their cellular immune responses, evaluate the immunogenicity of PPE antigens and explore their significance in tuberculosis diagnosis or vaccine research.
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2183021