發(fā)布時(shí)間：2018-08-14 12:22

【摘要】：近年,隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的老齡化,動(dòng)脈粥樣硬化已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的一大類疾病,它是造成心臟、腦及肢體缺血的主要原因。其發(fā)生、發(fā)展與炎癥反應(yīng)激活以及內(nèi)皮損傷有關(guān);同時(shí)機(jī)體內(nèi)又具有以內(nèi)皮祖細(xì)胞為代表的修復(fù)機(jī)制。血管病變的發(fā)生則是由損傷與修復(fù)的失衡所導(dǎo)致。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)的發(fā)生與多種心血管病危險(xiǎn)因素相關(guān),在當(dāng)今積極控制已知心血管病危險(xiǎn)因素(吸煙、血脂、血壓和血糖等)的情況下,以動(dòng)脈粥樣硬化病變?yōu)榛A(chǔ)的心腦血管病在我國仍然呈迅速上升的趨勢(shì)。這提示,在常見的心血管病危險(xiǎn)因素之外,還可能有一些危險(xiǎn)因素沒有被重視或控制。目前,感染因素與血栓和血管病變形成之間的關(guān)系日益受到重視,“感染負(fù)荷”已被認(rèn)定為ATS新的危險(xiǎn)因素和防治靶向1。例如,金黃色葡萄球菌是心血管系統(tǒng)感染的常見致病菌,是導(dǎo)致感染性心內(nèi)膜炎和糖尿病足患者動(dòng)脈血管病變的常見病原體之一。若能闡明某些感染因素在血管損傷與修復(fù)兩方面的作用,將有利于提高動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的防治水平。 金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5(staphylococcal superantigen -like protein-5, SSL5)是金黃色葡萄球菌(S. aureus)家族中的一員,屬分泌型蛋白。本研究旨在進(jìn)一步闡明金黃色葡萄球菌感染促進(jìn)血管病變形成的作用和機(jī)制,從而為預(yù)防感染所致血管病變的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。 目的:本研究在構(gòu)建SSL5蛋白表達(dá)載體的基礎(chǔ)上從人臍血中提取EPCs,并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定。研究SSL5與EPCs表面PSGL-1的特異性結(jié)合情況,以及SSL5對(duì)EPCs粘附、遷移、增殖等生物學(xué)特性的影響。 材料和方法:(1)構(gòu)建SSL5蛋白表達(dá)載體,從金黃色葡萄球NCTC8325菌株中擴(kuò)增出ssl5基因,將ssl5基因克隆于原核表達(dá)載體pET32a中,再轉(zhuǎn)染于大腸桿菌BL21中擴(kuò)增表達(dá),采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)SSL5蛋白純度;(2)采取密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)人臍血源性內(nèi)皮祖細(xì)胞,在內(nèi)皮系選擇性培養(yǎng)基(EGM-2)中培養(yǎng),采用免疫熒光對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。(3)采用激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)EPCs表面PSGL-1表達(dá);以FACS檢測(cè)SSL5與EPCs的結(jié)合能力,以及SSL5對(duì)“抗人PSGL-1單抗(KPL-1)與EPCs結(jié)合”的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。采用粘附實(shí)驗(yàn)、Millicell-PCF培養(yǎng)小室和CCK-8試劑盒分別檢測(cè)不同濃度SSL5 (0、1.0、3.0、10、30mg/L)對(duì)EPCs粘附、遷移、增殖活性的影響。 結(jié)果:(1)重組SSL5蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度90%。(2)分離獲得的人臍血源性EPCs具有干細(xì)胞集落形成能力,在內(nèi)皮選擇性培養(yǎng)基條件下,培養(yǎng)30天后能夠向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化,表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示, PSGL-1在EPCs表面有較豐富的表達(dá),陽性細(xì)胞率為76.6%。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,PE-KPL-1和FITC-UEA-1雙染陽性細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的66.3%。隨著SSL5濃度的增加,其與EPCs的結(jié)合量逐漸增加,同時(shí),SSL5可競(jìng)爭(zhēng)性抑制KPL-1與EPCs的結(jié)合。SSL5還可抑制EPCs在P-選擇素表面的黏附,并可對(duì)EPCs的遷移和增殖能力產(chǎn)生抑制作用。 結(jié)論:(1)人臍血源性EPCs表面有較豐富的PSGL-1表達(dá);(2) SSL5可與EPCs表面的PSGL-1結(jié)合并抑制EPCs在P-選擇素表面的黏附。這提示,SSL5可能通過抑制EPCs在損傷內(nèi)皮部位(有豐富的E-/P-選擇素表達(dá))的黏附,以及對(duì)EPCs遷移和增殖能力的抑制,最終導(dǎo)致EPCs修復(fù)功能下降,促進(jìn)血管病變的形成。
[Abstract]:In recent years, with the development of social economy and the aging of the population, atherosclerosis has become a serious threat to human health, which is the main cause of heart, brain and limb ischemia. The occurrence of atherosclerosis is associated with a variety of cardiovascular risk factors, and is based on atherosclerosis when known cardiovascular risk factors (smoking, blood lipids, blood pressure, blood sugar, etc.) are actively controlled. Cardiovascular and cerebrovascular diseases are still on the rise in China, which suggests that besides the common cardiovascular risk factors, some risk factors may not be taken seriously or controlled. Staphylococcus aureus, for example, is a common pathogen of cardiovascular system infections and is one of the common pathogens causing arterial lesions in patients with infective endocarditis and diabetic foot. It is beneficial to improve atherosclerosis and to clarify the role of certain infectious factors in vascular injury and repair. The level of prevention and treatment of complications.
Staphylococcal superantigen-like protein-5 (SSL5) is a secretory protein of Staphylococcus aureus (S. aureus). The purpose of this study is to further elucidate the role and mechanism of Staphylococcal infection in promoting angiopathy and thus preventing the blood vessels from infection. Lay the foundation for the occurrence of the disease.
Objective: To isolate and identify EPCs from human umbilical cord blood on the basis of constructing SSL5 protein expression vector, and to study the specific binding of SSL5 to PSGL-1 on the surface of EPCs, and the effects of SSL5 on the biological characteristics of EPCs such as adhesion, migration and proliferation.
Materials and Methods: (1) SSL5 protein expression vector was constructed, ssl5 gene was amplified from grape globe NCTC8325 strain, ssl5 gene was cloned into prokaryotic expression vector pET32a, and then transfected into E. coli BL21 for amplification and expression, and the purity of SSL5 protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis; (2) density gradient centrifugation combined with adherent culture was used for isolation. Human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells were cultured in the selective medium of endothelial cell line (EGM-2), and their surface markers were detected and identified by immunofluorescence. (3) The expression of PSGL-1 on the surface of EPCs was detected by confocal laser scanning and flow cytometry (FACS); the binding ability of SSL5 to EPCs was detected by FACS; and the anti-human PSGL-1 monoclonal antibody (KP) was detected by SSL5. The effects of different concentrations of SSL5 (0,1.0,3.0,10,30mg/L) on the adhesion, migration and proliferation of EPCs were studied by adhesion test, Millicell-PCF culture chamber and CK-8 kit.
Results: (1) The purity of recombinant SSL5 protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis. (2) The isolated human umbilical cord blood-derived EPCs could differentiate into mature endothelial cells after 30 days of culture in endothelial selective medium, and expressed CD31. (3) Flow cytometry showed that PSGL-1 was present in EP. The results of confocal laser microscopy showed that PE-KPL-1 and FITC-UEA-1 double-stained positive cells accounted for 66.3% of the total cells. With the increase of SSL5 concentration, the binding of EPCs to PE-KPL-1 increased gradually. At the same time, SSL5 could competently inhibit the binding of KPL-1 and EPCs. SSL5 could also inhibit the binding of EPCs in P. - the adhesion of selectin surface can inhibit the migration and proliferation of EPCs.
Conclusion: (1) Human umbilical cord blood-derived EPCs have abundant PSGL-1 expression; (2) SSL5 can bind to PSGL-1 on the surface of EPCs and inhibit the adhesion of EPCs to P-selectin. This suggests that SSL5 may inhibit the adhesion of EPCs to the damaged endothelium by inhibiting the expression of E-/P-selectin and the migration and proliferation of EPCs. The repair function of EPCs decreased, and the formation of vascular disease was promoted.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2182848