【摘要】：目的：初步探討人源性飼養(yǎng)層支持人胚胎干細(xì)胞的生長情況；初步探討人源性和鼠源性飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的bFGF與支持hESCs生長是否存在相關(guān)性。 方法：1本試驗(yàn)利用酶制劑消化法和微量液體組織塊貼壁法原代分離培養(yǎng)包皮,睪丸組織,減胎組織,胎兒皮膚、肌肉、肺組織成纖維細(xì)胞,進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)傳代、冷凍復(fù)蘇,通過接觸抑制和解除抑制研究細(xì)胞的增殖潛力,通過免疫熒光法對(duì)其進(jìn)行鑒定；2將人源性成纖維細(xì)胞制備成飼養(yǎng)層,同期接種同一株hESCs在人源性飼養(yǎng)層上,對(duì)比hESCs的貼壁率、克隆生長率及未分化率,比較它們支持hESCs生長的差異；3本試驗(yàn)通過ELISA方法,檢測評(píng)估人源性和鼠源性細(xì)胞分泌的bFGF,對(duì)飼養(yǎng)層分泌的bFGF和支持hESCs增殖和不分化生長進(jìn)行初步分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素組間方差分析比較各實(shí)驗(yàn)組之間的差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 結(jié)果：1已成功分離包皮真皮成纖維細(xì)胞,睪丸組織成纖維細(xì)胞,減胎組織成纖維細(xì)胞,引產(chǎn)胎兒皮膚、肌肉、肺組織成纖維細(xì)胞,在體外能穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代和冷凍、冷凍復(fù)蘇和接觸抑制解除后可以正常培養(yǎng)和傳代。免疫熒光鑒定細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性,角蛋白表達(dá)陰性,再結(jié)合其分離時(shí)的組織來源,細(xì)胞生長的特點(diǎn)及細(xì)胞形態(tài),證實(shí)其均為成纖維細(xì)胞。本試驗(yàn)比較了人源性飼養(yǎng)層支持hESCs生長的情況,排序?yàn)椋喊?胎肺-胎肌-胎皮-睪丸-減胎。傳三代減胎組織培養(yǎng)hESCs的未分化率均最低。 2本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠源性飼養(yǎng)層不能分泌任何可測量到的bFGF(敏感度0.22pg/mL),而人源性飼養(yǎng)層細(xì)胞均能分泌bFGF,包皮和減胎組織成纖維細(xì)胞在接種后6h就可以測到bFGF的分泌量,減胎組織成纖維細(xì)胞在接種24h和3d分泌的bFGF量均最高,包皮分泌的bFGF量均最低,且包皮、胎皮、胎肺24h和3d分泌bFGF量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1本試驗(yàn)建立了包皮真皮成纖維細(xì)胞系,睪丸組織成纖維細(xì)胞系,減胎組織成纖維細(xì)胞系,胎兒肺組織成纖維細(xì)胞系各2株；胎兒皮膚、肌肉組織成纖維細(xì)胞系各1株。凍存了大量傳代細(xì)胞以備用。 2人源性飼養(yǎng)層在一定程度上可以支持hESCs的生長,包皮成纖維細(xì)胞是一種值得推薦的飼養(yǎng)層細(xì)胞,但是在鼠源性飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的hESCs未分化率高于人源性。 3絲裂霉素處理不會(huì)抑制人源性飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的bFGF量。bFGF是促進(jìn)hESCs貼壁和增殖生長的重要因子,飼養(yǎng)層細(xì)胞自身分泌的bFGF能支持hESCs的貼壁和增殖生長,但不同飼養(yǎng)層支持hESCs生長的最適宜bFGF濃度和抑制hESCs分化的作用機(jī)制,還有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Aim: to investigate the relationship between the bFGF secreted by human and mouse feeder cells and the growth of human embryonic stem cells (hESCs). Methods the fibroblasts of prepuce, testicular tissue, fetal skin, muscle and lung were isolated and cultured by enzyme digestion method and microliquid tissue adherence method. The proliferation potential of human fibroblasts was studied by contact inhibition and release inhibition. Human fibroblasts were prepared into feeder layer by immunofluorescence method. At the same time, the same strain of hESCs was inoculated on the homogenous feeder layer, and the adherence rate of hESCs was compared. Clone growth rate and undifferentiated rate were compared to compare their differences in support of hESCs growth. 3. ELISA method was used in this experiment. BFGFs secreted by human and mouse derived cells were detected, and the bFGF secreted by feeder layer and those supporting hESCs proliferation and undifferentiated growth were analyzed. The data were processed by SPSS 13.0 software package. The measurement data were expressed as mean 鹵standard deviation (X 鹵S). The differences among the experimental groups were compared by using the homogeneity test of variance and the analysis of variance among the single factor groups. Results the fibroblasts of prepuce dermis, testicular tissue, reduced fetal tissue, fetal skin, muscle and lung could be cultured, subcultured and frozen in vitro. Cryopresuscitation and contact inhibition can be cultured and subcultured normally. Positive expression of vimentin and negative expression of keratin were identified by immunofluorescence. Combined with the source of tissue, the characteristics of cell growth and cell morphology, it was confirmed that the cells were fibroblasts. In this experiment, the human feeder layer supported hESCs growth in the order of prepuce-fetal lung-fetal muscle-fetal skin-testis-reduced fetus. The undifferentiated rate of hESCs was the lowest in the third generation of reduced fetal tissue culture. 2 it was found that the murine feeder layer could not secrete any detectable bFGF (sensitive 0.22pg/mL), while the human derived feeder layer cells could secrete bFGFs, prepuce and pericardium. The amount of bFGF secreted by fibroblasts was measured 6 hours after inoculation. The amount of bFGF secreted by fibroblasts was the highest at 24 hours and 3 days after inoculation, and the bFGF secreted by prepuce was the lowest. There was no significant difference in the amount of bFGF secreted by prepuce, 24 h and 3 d of fetal lung. Conclusion the cell lines of prepuce dermis fibroblast testicular tissue fibroblast fetal lung fibroblast and fetal skin and muscle fibroblast were established in this experiment. Cryopreserved a large number of passage cells to reserve. 2 human feeder layers can support the growth of hESCs to some extent, prepuce fibroblasts are a kind of recommended feeder layer cells, However, the undifferentiated rate of hESCs cultured on murine feeder was higher than that of human. 3 the amount of bFGF produced by mitomycin could not inhibit the secretion of bFGF. BFGF was an important factor to promote the adhesion and proliferation of hESCs. The bFGF secreted by feeder cells can support the adhesion and proliferation of hESCs, but the optimal concentration of bFGF and the mechanism of inhibiting the differentiation of hESCs in different feeder layers need to be further studied.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2181723