【摘要】：目的： 觀察成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外缺氧環(huán)境下對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成能力的影響并探討其可能機(jī)制，為干細(xì)胞更好的應(yīng)用于臨床上缺血缺氧性疾病的治療提供理論依據(jù)。 方法： 收集成人骨髓血，密度梯度離心法收集分離BMSCs并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，傳至第4代用于實(shí)驗(yàn)；流式細(xì)胞技術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)志物。 收集BMSCs常氧環(huán)境(氧濃度為21%)下培養(yǎng)24h和缺氧環(huán)境下(含1%O2，5%CO2和94%N2的混合氣體環(huán)境)培養(yǎng)24h后的細(xì)胞上清液即條件培養(yǎng)基。HUVECs傳代培養(yǎng)后分成3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：對照組、 BMSCsCMN-HUVECs組和BMSCsCMH-HUVECs組，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于缺氧環(huán)境下用含不同條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)液培養(yǎng)，體外血管形成實(shí)驗(yàn)分析3組HUVECs在Matrigel上管腔樣結(jié)構(gòu)形成情況，并進(jìn)行量化比較；MTT檢測3組HUVECs增殖能力。 BMSCs在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)0h、12h、24h和48h后，RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)SDF-1和VEGF的基因表達(dá)情況，0h為對照組，12h、24h和48h為實(shí)驗(yàn)組；ELISA法檢測細(xì)胞上清液中SDF-1和VEGF的蛋白含量。 結(jié)果： 1.人BMSCs傳至第4代呈漩渦狀長梭形即纖維母細(xì)胞樣生長；對數(shù)生長期的HUVECs多為多角形或短梭形，呈”鋪路石”樣排列生長 2.人BMSCs陽性表達(dá)CD29、CD44和CD90，而陰性表達(dá)CD34、CD45和CD106 3. BMSCsCMH-HUVECs組管腔樣結(jié)構(gòu)多于對照組和BMSCsCMN-HUVECs組。[14±2.3與3±0.59；14±2.3與5±1.1，P＜0.05] 4.不同缺氧時(shí)間點(diǎn)(12h，24h和48h)BMSCsCMH-HUVECs組細(xì)胞增殖能力均顯著高于對照組和BMSCsCMN-HUVECs組。[0.54±0.053與0.33±0.041，0.68±0.091與0.42±0.048，0.72±0.106與0.49±0.074；0.54±0.053與0.31±0.041，0.68±0.091與0.43±0.071，0.72±0.106與0.51±0.086，P＜0.05] 5.不同缺氧時(shí)間點(diǎn)(12h，24h和48h)BMSCs的SDF-1和VEGF基因表達(dá)水平均顯著高于對照組。[VEGF：0.718±0.048vs0.532±0.081，0.922±0.104vs0.532±0.081，0.843±0.092vs0.532±0.081；SDF-1：0.569±0.091vs0.361±0.035，0.701±0.046vs0.361±0.035，0.695±0.074vs0.361±0.035，P＜0.05] 6. BMSCsCMH中SDF-1和VEGF蛋白含量均明顯高于BMSCsCMN。[SDF-1：(4.52±0.44)ng/106cells與(1.37±0.09) ng/106cells；VEGF：(7.94±0.89) ng/106cell與(2.75±0.23) ng/106cells，P＜0.05]。 結(jié)論： 1.缺氧環(huán)境下收集的條件培養(yǎng)基即BMSCsCMH顯著提高HUVECs增殖和在Matrigel上管腔樣結(jié)構(gòu)形成能力； 2.缺氧顯著上調(diào)BMSCs的SDF-1和VEGF基因表達(dá)，，并促進(jìn)二者大量分泌至細(xì)胞上清液中發(fā)揮作用； 3.成人BMSCs在缺氧環(huán)境下通過旁分泌SDF-1和VEGF提高血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性和管腔樣結(jié)構(gòu)形成能力，促進(jìn)血管新生。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of adult bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on the proliferation and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under hypoxia in vitro and to explore its possible mechanism. To provide a theoretical basis for the better application of stem cells in the treatment of ischemic and hypoxic diseases. Methods: adult bone marrow blood was collected, BMSCs was isolated by density gradient centrifugation and cultured in vitro, then transmitted to the 4th passage for experiment. Flow cytometry was used to identify the surface markers of BMSCs. The supernatant of BMSCs cells cultured in normoxic environment (21% oxygen concentration) and hypoxic environment (containing 1O2 / 5CO2 and 94%N2 mixed gas) for 24 hours was divided into three groups: control group, BMSCsCMN-HUVECs group and BMSCsCMH-HUVECs group. The cells of each experimental group were cultured in anoxic medium with different conditioned media. In vitro angiogenesis experiment was conducted to analyze the formation of HUVECs in the lumen of Matrigel and to compare it quantitatively. MTT was used to detect the proliferative ability of HUVECs in the three groups. The expression of SDF-1 and VEGF genes in the cells were detected by RT-PCR for 24 h and 48 h after cultured in hypoxic environment for 12 h and 48 h respectively. The protein levels of SDF-1 and VEGF in the supernatant of the cells were detected by Elisa for 12 h and 48 h in the control group respectively. Results: 1. In the fourth generation, human BMSCs grew like fibroblasts, and HUVECs in logarithmic growth period was polygonal or short fusiform, and grew like "paving stone". Human BMSCs was positive for CD29, CD44 and CD90, but negative for CD34, CD45 and CD106. The lumen like structure of BMSCsCMH-HUVECs group was more than that of control group and BMSCsCMN-HUVECs group. [14 鹵2.3 vs 3 鹵0.59n14 鹵2.3 vs 5 鹵1.1 P < 0. 05] 4. The proliferative ability of BMSCsCMH-HUVECs group was significantly higher than that of control group and BMSCsCMN-HUVECs group at 12h and 48h. [0.54 鹵0.053 vs 0.33 鹵0.041 鹵0.68 鹵0.091 vs 0.42 鹵0.048 鹵0.72 鹵0.106 and 0.49 鹵0.074 鹵0.54 鹵0.053 vs 0.31 鹵0.041 0.68 鹵0.091 vs 0.43 鹵0.071 鹵0.72 鹵0.106 and 0.51 鹵0.086U P < 0. 05] 5. The expression of SDF-1 and VEGF gene in BMSCs at different hypoxia time points (12h, 24h and 48h) was significantly higher than that in control group. [VEGF:0.718 鹵0.048vs0.532 鹵0.081 鹵0.922 鹵0.104vs0.532 鹵0.081 鹵0.843 鹵0.081]. SDF-1: 0.569 鹵0.091vs0.361 鹵0.035 鹵0.701 鹵0.046vs0.361 鹵0.030.695 鹵0.074vs0.361 鹵0.035 (P < 0. 05). The protein contents of SDF-1 and VEGF in BMSCsCMH were significantly higher than those in BMSCsCMNs. [SDF-1: (4.52 鹵0.44) ng/106cells and (1.37 鹵0.09) ng / 106 cells: (7.94 鹵0.89) ng/106cell and (2.75 鹵0.23) ng / 106 cells P < 0.05]. Conclusion: 1. The conditioned culture medium (BMSCsCMH) collected in anoxic environment significantly increased the proliferation of HUVECs and the ability of forming lumen structure on Matrigel. 2. Hypoxia significantly upregulated the expression of SDF-1 and VEGF genes in BMSCs and promoted their secretion into the supernatant of cells. Adult BMSCs promotes angiogenesis by paracrine SDF-1 and VEGF in hypoxic environment.
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2181427