【摘要】：手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是發(fā)生在嬰幼兒之間的常見病毒性傳染病。早在上個(gè)世紀(jì)60年代就已經(jīng)報(bào)道了該病的流行,1957年首次對(duì)加拿大兒童感染手足口病進(jìn)行了描述;1958年J.Alsop等從病人的皰疹液中分離出了柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus 16, CA16);1959年將此類疾病正式命名為“手足口病”;1969年,在美國加利福尼亞分離出首株腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71),之后在世界范圍內(nèi)每年都會(huì)有手足口病的流行報(bào)道。近幾年,手足口病在亞太地區(qū)流行呈上升趨勢(shì),2008年手足口病在我國大陸地區(qū)暴發(fā)流行造成了近50萬例兒童感染,120例患者死亡,而且手足口病高發(fā)期每天都有新增死亡病例出現(xiàn),引起了全國人民的恐慌。自2008年5月國家將該病列為丙類傳染病以來,手足口病發(fā)病率和死亡率逐年攀升,成為危害嬰幼兒健康和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病,日益受到人們的重視。 引起手足口病的病原體主要為腸道病毒,其中包括柯薩奇病毒A組(16、4、5、7、9、10型)和B組(2、5、13型),腸道病毒(68、71型)以及�？刹《�,其中EV71和CA16交替出現(xiàn),成為我國近幾年流行的兩種主要病原體。由EV71感染引起的手足口病具有高發(fā)病率和死亡率的特征,伴有嚴(yán)重的神經(jīng)源性并發(fā)癥,包括病毒性腦膜炎,腦炎,以及脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹,引起的肺水腫、肺出血經(jīng)常導(dǎo)致嬰幼兒快速死亡;CA16會(huì)引起心肌炎、心包炎等嚴(yán)重疾病,也日益受到重視。EV71病毒劃分為A、B、C三個(gè)基因型,進(jìn)一步細(xì)分為A,B1 5和C1 4亞型,近年來我國EV71型手足口病的流行以C4亞型為主。機(jī)體抵抗EV71感染的免疫應(yīng)答包括天然免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答,其中在特異性免疫應(yīng)答中由B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答在預(yù)防與控制EV71感染中占有重要地位。 自古以來,疫苗是控制傳染病流行最為有效而經(jīng)濟(jì)的手段。目前,手足口病疫苗研究以EV71為主。由于EV71致病機(jī)制和免疫應(yīng)答機(jī)制尚未闡明,雖然已經(jīng)開展了多種EV71疫苗的研究,并取得了很大進(jìn)展,但是至今仍未開發(fā)出有醫(yī)藥商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的疫苗。盡管EV71滅活疫苗相比其它類型的疫苗具有較強(qiáng)的抗病毒保護(hù)作用,但是滅活疫苗往往存在比較嚴(yán)重的安全性問題,如核酸殘留、免疫過激等,尤其是手足口病疫苗防護(hù)的人群主要是嬰幼兒,最終能否用于臨床仍然不明。EV71 DNA疫苗和亞單位蛋白疫苗免疫保護(hù)效果不如滅活苗,離應(yīng)用有較大距離。近年來,病毒樣顆粒疫苗(VLP)為病毒類疫苗研究開辟了新的方向,VLPs疫苗因其缺乏病毒核酸以及顆粒較為完整、抗原表位全面等優(yōu)點(diǎn),成為新型疫苗中的一大亮點(diǎn)。目前,以HPV VLP疫苗為代表的病毒樣顆粒疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。手足口病EV71 VLP疫苗研究雖然也有報(bào)道,但是缺乏更全面深入的研究。本研究根據(jù)近年中國EV71流行株的特點(diǎn)圍繞EV71型手足口病VLP疫苗開展了以下幾方面的研究,為手足口病疫苗研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究通過免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子流行病學(xué)、分子生物學(xué)、疫苗學(xué)的最新技術(shù),分析EV71型手足口病病毒流行株生物學(xué)特征和基因型別,分離、鑒定和篩選EV71疫苗株和攻毒株,并對(duì)兩者基因組進(jìn)行生物信息學(xué)比較分析;采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EV71型手足口病VLP蛋白,探索EV71 VLP最新純化方法,獲得純度較高的EV71 VLP抗原;制備EV71型手足口病VLP疫苗和EV71滅活苗劑型,并對(duì)其進(jìn)行免疫原性和免疫保護(hù)性的評(píng)價(jià)。 研究方法: 1.將國內(nèi)近幾年手足口病患者臨床樣本(咽拭子、皰疹液、肛拭子等)處理后接種至Vero細(xì)胞,盲傳兩代后,將出現(xiàn)典型細(xì)胞病變的樣本依次進(jìn)行RT-PCR鑒定、蝕斑純化、滴度測(cè)定、電鏡觀察以及EV71 VP1基因序列同源性比對(duì)和進(jìn)化分析; 2.將EV71分離株進(jìn)行免疫原性、交叉保護(hù)性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià),篩選疫苗候選株;將EV71分離株腦內(nèi)注射ICR乳鼠,取能夠?qū)е氯槭蟀l(fā)病的EV71毒株在ICR乳鼠上進(jìn)行傳代馴化,篩選致乳鼠穩(wěn)定發(fā)病死亡的攻毒株,建立EV71小鼠感染致病模型;通過反轉(zhuǎn)錄獲得疫苗候選株和攻毒株的全長cDNA并進(jìn)行全基因組測(cè)序,用生物信息學(xué)軟件對(duì)基因組中關(guān)鍵部位核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析; 3.從EV71疫苗候選株中確定1株作為后續(xù)研究的疫苗株;提取疫苗株RNA,通過反轉(zhuǎn)錄獲得全長cDNA,PCR擴(kuò)增P1和3CD基因,并分別克隆到同一個(gè)質(zhì)粒pFastBacDual上的Pph和P10啟動(dòng)子下游,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài),通過藍(lán)白斑篩選陽性重組菌,提取重組Bacmid DNA并轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,收獲重組桿狀病毒并進(jìn)行EV71 VLP蛋白的表達(dá);經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlot、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)及透射電鏡觀察對(duì)EV71 VLP蛋白進(jìn)行全面鑒定; 4.通過懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞sf9進(jìn)行EV71 VLP的大量表達(dá);通過30KD超濾膜濃縮→30%-60%蔗糖密度梯度離心→DEAE陰離子交換層析→4FF凝膠層析的方法對(duì)EV71 VLP進(jìn)行純化;通過SDS-PAGE、WesternBlot檢測(cè)及透射電鏡觀察初步鑒定抗原純化效果; 5.測(cè)定EV71 VLP抗原和EV71滅活全病毒抗原(抗原對(duì)照)蛋白含量后,選擇氫氧化鋁和SP01兩種佐劑制備疫苗劑型;將制備的EV71 VLP疫苗和滅活疫苗免疫6-8周齡Balb/c小鼠,通過ELISA、中和試驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和脾淋巴細(xì)胞亞型分析來綜合評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性;通過體外中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)疫苗對(duì)現(xiàn)有EV71流行株的交叉保護(hù)作用;將EV71 VLP疫苗免疫受孕母鼠,并用EV71攻毒株對(duì)新生乳鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn),比較小鼠存活率,評(píng)價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果。 研究結(jié)果: 1.從441份臨床手足口病患者樣本中分離到35株EV71型手足口病病毒(病毒滴度105CCID_(50)/ml),基于病毒VP1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果,表明本研究分離出的EV71流行株基因型均為C4亞型;篩選到2株EV71疫苗候選株(BJ01和LCH02),兩者在Vero細(xì)胞上的病毒滴度均大于10~(7.5)CCID_(50)/ml,免疫小鼠后血清抗體效價(jià)均大于2~(11),中和抗體效價(jià)為2~8;15代內(nèi)疫苗候選株的VP1基因序列同源性為99.99%,氨基酸序列同源性為100%;從這2株EV71疫苗候選株中確定其中1株(BJ01)作為疫苗株,另1株(LCH02)作為備選;篩選并馴化出1株EV71攻毒株(LCH01),攻擊1日齡ICR乳鼠后5天開始發(fā)病,典型癥狀為后肢癱瘓,從第6天開始出現(xiàn)死亡,14天后全部死亡,經(jīng)測(cè)定LCH01攻毒株在Vero細(xì)胞上的病毒滴度為10~8CCID_(50)/ml,對(duì)1日齡乳鼠的毒力為108~LD_(50)/ml; 2.采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建重組桿狀病毒Baculovirus-P1-3CD,病毒滴度可達(dá)108PFU/ml;SDS-PAGE、Westernblot以及間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果均證明了EV71 VLP的表達(dá),透射電鏡顯示VLP大小在25-30nm之間,與完整的病毒顆粒結(jié)構(gòu)一致;通過超濾濃縮→蔗糖密度梯度離心→陰離子交換層析→凝膠層析純化EV71 VLP,獲得了純度在95%以上的EV71 VLP抗原; 3.本研究選擇鋁鹽和SP01佐劑與EV71 VLP抗原和EV71滅活病毒抗原混合制備疫苗劑型,其中鋁鹽的使用按常規(guī)劑量1mg/ml與抗原進(jìn)行吸附,SP01佐劑稀釋后以等體積與抗原進(jìn)行吸附,制備出6種候選疫苗劑型; 4.本研究制備的VLP疫苗免疫鼠血清中和抗體效價(jià)比滅活全病毒疫苗高;含佐劑(鋁佐劑或SP01)疫苗比不含佐劑疫苗高;本實(shí)驗(yàn)室自制佐劑SP01比鋁佐劑更能增強(qiáng)疫苗的免疫效果,血清抗體效價(jià)峰值為2~(15),中和抗體效價(jià)峰值為2~(11);EV71 VLP疫苗和EV71滅活疫苗免疫小鼠血清均能夠高效中和不同時(shí)間、不同地區(qū)的EV71流行株;ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)得VLP疫苗組血清中IFN-γ和IL-4水平比滅活疫苗組高,MTT結(jié)果表明VLP疫苗相比滅活苗能刺激產(chǎn)生更多特異性脾淋巴細(xì)胞,FACS分析結(jié)果顯示出VLP疫苗能夠激發(fā)CD4+T細(xì)胞的顯著上升; 5.在攻毒劑量為50 LD_(50)時(shí),疫苗組小鼠存活率均達(dá)到100%;而對(duì)照組為0%。在攻毒劑量為500 LD_(50)時(shí),VLP+SP01組、VLP +鋁佐劑組和EV71+SP01組小鼠存活率分別達(dá)到90%,77%和72%;EV71+鋁佐劑組、VLP組和EV71滅活全病毒組小鼠存活率分別達(dá)到60%,55%和50%,對(duì)照組小鼠全部死亡。 結(jié)論: 1.本研究成功篩選出2株免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)好以及穩(wěn)定性高的毒株作為制備EV71疫苗候選株,其中確定了BJ01株作為本研究用疫苗株,同時(shí)篩選出1株滴度高、毒力強(qiáng)的LCH01病毒株作為EV71 VLP疫苗免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)的攻毒株; 2.本研究采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)EV71 VLP蛋白,初步建立了超濾濃縮→蔗糖密度梯度離心→DEAE陰離子交換層析→凝膠層析純化EV71 VLP的技術(shù),純度可達(dá)95%以上; 3.本研究選用鋁鹽和SP01佐劑成功制備了疫苗劑型,免疫小鼠后,免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EV71 VLP疫苗相比滅活苗能激發(fā)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有較強(qiáng)的免疫原性和交叉免疫保護(hù)性。兩種佐劑均能夠增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答,其中SP01佐劑增強(qiáng)作用更強(qiáng)。以混合SP01佐劑的EV71 VLP疫苗免疫小鼠能夠產(chǎn)生更高的免疫保護(hù)效果。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 孫唯;祝小平;曹慧;;我國手足口病防治研究現(xiàn)狀[J];寄生蟲病與感染性疾病;2012年03期

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本文編號(hào)：2180379