【摘要】：從低等生物開始,C型凝集素受體(CLRs)作為一類重要的模式識(shí)別受體(PRRs)就一直發(fā)揮著識(shí)別病原體、抵抗感染的作用。有的C型凝集素可直接誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),激活NF-κB通路,導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。值得關(guān)注的是還有很多C型凝集素通過多種途徑協(xié)同或拮抗Toll樣受體(TLRs)信號(hào),誘導(dǎo)免疫反應(yīng)抵抗微生物感染;或干擾TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),導(dǎo)致微生物免疫逃逸。 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞C型凝集素分子LSECtin是本實(shí)驗(yàn)室劉萬里博士等人在國際上率先克隆并研究的一種新型凝集素分子。與已知的凝集素分子DC-SIGN、DC-SIGNR和CD23屬于同一家族,共屬于C型凝集素超家族。該家族成員DC-SIGN作為病原微生物識(shí)別受體,通過直接誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)或通過調(diào)控TLRs胞內(nèi)信號(hào),在微生物感染與免疫方面發(fā)揮重要的功能。我們推測LSECtin作為一種新的CLRs,很可能在機(jī)體先天免疫反應(yīng)中扮演重要角色。 本文中我們揭示:(1)LSECtin是一種新的細(xì)菌識(shí)別分子:通過細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)LSECtin可以與大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌結(jié)合,并且可以被Ca2+的螯合劑EGTA所抑制。由于大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏桿菌都是革蘭氏陰性菌,革蘭氏陰性菌的主要成分都是脂多糖(LPS),因此我們推測LSECtin可能與脂多糖LPS存在相互作用,并在LPS介導(dǎo)的信號(hào)通路及其免疫反應(yīng)中發(fā)揮功能。(2)LSECtin表達(dá)于巨噬細(xì)胞:通過PCR檢測,證實(shí)LSECtin表達(dá)于小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞和骨髓來源的小鼠原代巨噬細(xì)胞(BMMφ);在LPS刺激的條件下,LSECtin的表達(dá)上調(diào)。(3)LSECtin正調(diào)控LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路及其免疫效應(yīng):在整體水平上,在LPS誘導(dǎo)的小鼠休克模型中,與WT小鼠相比,LSECtin-/-小鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子分泌明顯減少、肺臟的損傷明顯減輕、小鼠死亡率明顯下降。在細(xì)胞水平上,敲低RAW264.7內(nèi)LSECtin的表達(dá)后,LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子明顯下降;敲除BMMφ內(nèi)的LSECtin,LPS誘導(dǎo)的BMMφ分泌炎癥細(xì)胞因子分泌也明顯下降。在分子水平上,在LPS刺激的條件下,敲低LSECtin導(dǎo)致RAW264.7內(nèi)的IκB的降解減慢以及p38和JNK1/2的磷酸化水平下降;敲除LSECtin導(dǎo)致BMMφ內(nèi)的IκB的降解減慢以及p38和JNK1/2的磷酸化水平下降;相反,過表達(dá)LSECtin導(dǎo)致IκB降解加快以及p38和JNK1/2的磷酸化水平增強(qiáng)。(4)LSECtin促進(jìn)TLR4在巨噬細(xì)胞表面的定位,上調(diào)其接頭分子MyD88的募集,從而調(diào)控NF-κB信號(hào)通路及其免疫效應(yīng)分子的產(chǎn)生:我們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了LSECtin通過其CRD功能結(jié)構(gòu)域與TLR4、CD14和MD-2發(fā)生相互作用。進(jìn)而我們證實(shí)在LPS刺激的條件下,與WT BMMφ相比,LSECtin-/-BMMφ表達(dá)的TLR4的比例以及平均熒光強(qiáng)度均明顯下降,表明LSECtin促進(jìn)TLR4在BMMφ表面的定位。在LPS刺激的條件下,敲低LSECtin導(dǎo)致RAW264.7內(nèi)MyD88的表達(dá)下降,敲除LSECtin導(dǎo)致BMMφ內(nèi)MyD88的表達(dá)下降;相反,過表達(dá)LSECtin上調(diào)MyD88的表達(dá)。因此,LSECtin促進(jìn)了MyD88接頭分子的募集。(5) LSECtin可能以膜形式而非可溶形式發(fā)揮功能:我們有趣的發(fā)現(xiàn)在LSECtin敲除的BMMφ中加入可溶性LSECtin蛋白不能挽救因LSECtin缺失導(dǎo)致的細(xì)胞因子分泌減少;LSECtin可溶性蛋白也不能逆轉(zhuǎn)LSECtin缺失導(dǎo)致的小鼠休克死亡率下降。因此可推測LSECtin自身必須錨定在膜上,才能促進(jìn)TLR4的定位。 綜上所述,本文揭示LSECtin作為一種C型凝集素分子,可正調(diào)控LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路及其免疫效應(yīng)。
[Abstract]:Starting from lower organisms, C type lectin receptor (CLRs), as an important type of pattern recognition receptor (PRRs), has been playing the role of identifying pathogens and resisting infection. Some C lectin can directly induce intracellular signal conduction, activate NF- kappa B pathway, and lead to the production of inflammatory cytokines. There are many C agglutinin. The Toll - like receptor (TLRs) signal is synergized or antagonized by a variety of pathways, inducing immune response to resistance to microbial infection, or interfering with TLRs signal transduction, leading to the escape of microorganism immunity.
The C lectin molecule LSECtin of the hepatic sinusoidal endothelial cells is a new lectin molecule, which was first cloned and studied by Dr. Liu Wanli and others in the laboratory. It belongs to the same family with the known lectin molecules, DC-SIGN, DC-SIGNR and CD23, and belongs to the C type lectin superfamily. The family member DC-SIGN is recognized as a pathogenic microorganism. Body, by direct induction of intracellular signals or by regulating TLRs intracellular signals, plays an important role in microbial infection and immunity. We speculate that LSECtin, as a new CLRs, is likely to play an important role in the body's innate immune response.
In this article we reveal: (1) LSECtin is a new type of bacterial recognition molecule: by bacterial adhesion experiments, we have confirmed that LSECtin can be combined with Escherichia coli and Salmonella typhimurium and can be suppressed by the Ca2+ chelating agent EGTA. The main components are lipopolysaccharide (LPS), so we speculate that LSECtin may interact with lipopolysaccharide LPS and play a role in the LPS mediated signaling pathway and its immune response. (2) LSECtin is expressed in macrophages: LSECtin is expressed in mouse macrophage RAW264.7 cells and bone marrow derived mice by PCR detection. On the condition of LPS stimulation, the expression of LSECtin was up regulated. (3) LSECtin regulates the TLR4 signaling pathway induced by LPS and its immune effect: on the whole level, in the mouse shock model induced by LPS, the secretion of inflammatory cytokines in the LSECtin-/- mice is significantly reduced and the lung damage is obviously reduced, compared with WT mice. The death rate of mice decreased significantly. At the cell level, the expression of LSECtin in the low RAW264.7, the secretion of inflammatory cytokines induced by LPS induced RAW264.7 cells decreased obviously; the LSECtin in BMM [Phi], the secretion of inflammatory cytokines secreted by LPS induced BMM [Phi] also decreased obviously. In the molecular water, the low LSECtin led to R under the condition of LPS stimulation. The degradation of I kappa B in AW264.7 and the decrease of phosphorylation of p38 and JNK1/2; knockout LSECtin leading to the degradation of I kappa B in BMM and the decline in the phosphorylation level of p38 and JNK1/2; on the contrary, overexpression LSECtin leads to accelerated degradation and enhancement of phosphorylation. (4) promote the surface of macrophages. Localization, up-regulation the recruitment of its joint molecule MyD88, thus regulating the production of NF- kappa B signaling pathway and its immune effector molecules: we have demonstrated that LSECtin interaction with TLR4, CD14 and MD-2 through its CRD functional domain by immunoprecipitation experiments. Further we confirm that, under the condition of LPS stimulation, LSECtin-/-BMM [LSECtin-/-BMM] is compared with WT BMM. The ratio of the expression of TLR4 and the average fluorescence intensity decreased obviously, indicating that LSECtin promoted the localization of TLR4 on the surface of BMM phi. Under the condition of LPS stimulation, the expression of MyD88 in RAW264.7 decreased and the expression of LSECtin led to MyD88 in BMM. The recruitment of MyD88 connector molecules. (5) LSECtin may be functional in the form of membrane and not in soluble form: We interesting to find that the addition of soluble LSECtin protein in the BMM phi of LSECtin knockout can not save the decrease of cytokine secretion due to LSECtin deletion, and LSECtin soluble egg white can not reverse the shock induced by LSECtin deletion in mice. Therefore, it is possible to speculate that LSECtin itself must be anchored on the membrane to promote TLR4 localization.
In conclusion, LSECtin, as a C-type lectin molecule, can positively regulate LPS-induced TLR4 signaling pathway and its immune effect.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2172001