【摘要】：脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ASCs)是脂肪組織中存在的一種成體干細(xì)胞,具有便于取材,可向三個(gè)胚層方向分化等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要研究ASCs的體外分離培養(yǎng)條件優(yōu)化；ASCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、精子細(xì)胞的誘導(dǎo)分化；Reversine對(duì)ASCs生物學(xué)特性的影響。 通過MTT、免疫組化及RT-PCR證明,分離培養(yǎng)的ASCs在35代內(nèi)保持良好的生物學(xué)特性,P5、P15、P25細(xì)胞倍增時(shí)間分別為34.6h、37.8h、38.3h；持續(xù)表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD29、CD44,不表達(dá)造血干細(xì)胞特異表面抗原CD45；表達(dá)特異性基因CD29、CD34、CD90、Sca-1、c-Myc,不表達(dá)Sox-2和Oct-4。說明本實(shí)驗(yàn)采用的ASCs的分離培養(yǎng)方法能夠保持ASCs的未分化狀態(tài)。 ASCs在成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下分化為脂肪細(xì)胞,誘導(dǎo)第六天油紅O染色計(jì)算P5ASCs誘導(dǎo)率為78.3%±9.2%,P15ASCs誘導(dǎo)率為73.9%±8.7%,P25ASCs誘導(dǎo)率為67.0%±1.52%,不同代數(shù)間誘導(dǎo)率無(wú)顯著性差異；在成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下分化為成骨細(xì)胞,第11天進(jìn)行茜素紅染色,鈣結(jié)節(jié)被染成深紅色,放大100倍視野下計(jì)數(shù)被染色的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量,P5ASCs為15±2.4個(gè),P15ASCs為13±3.6個(gè),不同代數(shù)之間無(wú)顯著性差異；P5ASCs與睪丸組織共培養(yǎng),10天后RT-PCR結(jié)果顯示表達(dá)精子細(xì)胞特異基因Prml、Acr。 Reversine終濃度大于5μmol/L時(shí)對(duì)ASCs有明顯的細(xì)胞毒性,濃度為1μmol/L時(shí),對(duì)ASCs的增殖率無(wú)明顯影響,但可以顯著增加ASCs向脂肪細(xì)胞,成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率。 本實(shí)驗(yàn)建立了ASCs分離培養(yǎng)體系,ASCs可以在此體系內(nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)并保持良好的生物學(xué)特性：證明了ASCs具有在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及精子細(xì)胞分化的潛能；同時(shí)證明了reversine可以提高ASCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)分化率,是一種有效的提高ASCs分化潛能的小分子。
[Abstract]:Adipose-derived stem cells are one of the adult stem cells in adipose tissue. The aim of this study was to study the effects of Reversine on the biological characteristics of ASCs by optimizing the differentiation of ASCs into adipocytes, osteoblasts and sperm cells in vitro. The results of MTT, immunohistochemistry and RT-PCR showed that the biological characteristics of ASCs isolated and cultured were 34.6 h / 37.8 h and 38.3 h, respectively, and the cell surface antigen CD29 + CD44 was not expressed in vitro, and the specific surface antigen CD45 was not expressed in the cultured ASCs during the 35 passages, and the doubling time of P5 / P15 / P25 cells was 37.6 h / 37.8 h and 38.3 h / 38.3 h, respectively. The specific gene CD29, CD34, CD90, Sca-1, c-Myc, did not express Sox-2 and Oct-4. The results showed that the ASCs isolated and cultured in this experiment could maintain the undifferentiated state of ASCs. ASCs differentiated into adipocytes induced by adipogenic inducer. On the sixth day of induction, the induction rate of P5ASCs by oil red O staining was 78.3% 鹵9.2% and that of P15ASCs was 73.9% 鹵8.7%. The induction rate of P25ASCs was 67.0% 鹵1.522.There was no significant difference between different generations, the osteoblasts differentiated into osteoblasts induced by osteogenic inducers, and alizarin red staining was performed on the 11th day. The number of P5ASCs was 15 鹵2.4 and P15ASCs were 13 鹵3.6. There was no significant difference between different algebras. After 10 days of co-culture of P5ASCs with testicular tissue, RT-PCR results showed that the final concentration of PrmlAcr.Reversine expressing spermatocyte specific gene was more than 5 渭 mol / L, which had obvious cytotoxicity to ASCs, and when the concentration was 1 渭 mol / L, the proliferation rate of ASCs was not significantly affected. But it can significantly increase the efficiency of ASCs induced differentiation into adipocytes and osteoblasts. In this experiment, the ASCs isolation and culture system can be cultured in this system for a long time and maintain good biological characteristics. It is proved that ASCs have the potential to differentiate into adipocytes, osteoblasts and sperm cells under suitable induction conditions. At the same time, it is proved that reversine can increase the transdifferentiation rate of adipocytes and osteoblasts, and it is an effective small molecule to improve the differentiation potential of ASCs.
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2131984