【摘要】：B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS),又稱腫瘤壞死因子家族的B細(xì)胞活化分子(B cell-activating factor belonged to TNF family, BAFF)是一重要的腫瘤壞死因子超家族成員。增值誘導(dǎo)配體(APRIL,又叫TALL-2、TRDL-1及TNFSF-13)與BAFF的蛋白序列具有33%的同源性。穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interactor, TACI)和B細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)是APRIL和BAFF共同的受體。本文中我們進(jìn)行了人TACI胞外區(qū)功能域CRD2基因的克隆,基于受體和Fc的晶體結(jié)構(gòu),通過計算機模擬技術(shù)、分子對接方法,構(gòu)建了人雙受體融合基因酵母表達(dá)載體-pPIC9K-CRD2-TACI-IgGFc,實現(xiàn)了重組CRD2-TACI-Fc融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化后進(jìn)行了生物學(xué)活性的鑒定。旨在為進(jìn)一步研究BLyS/APRIL與其受體的相互作用模式和開發(fā)用于治療自身免疫疾病的BLyS/APRIL拮抗劑奠定基礎(chǔ)。該項研究取得的主要結(jié)果如下： (1)經(jīng)PCR成功克隆了編碼人TACI的胞外段功能域CRD2基因,測序結(jié)果與GenBank結(jié)果一致。 (2)擴增的TACI胞外區(qū)功能域CRD2與TACI-Fc段基因連接后插入真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K,成功地構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-CRD2-TACI-IgGFc。 (3)上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。經(jīng)甲醇誘導(dǎo),并優(yōu)化誘導(dǎo)條件,獲得了較高水平的表達(dá)。SDS-PAGE分析可見,在46kDa處有目的條帶。Western Blot結(jié)果表明該蛋白與抗TACI抗體顯陽性反應(yīng)。蛋白序列的質(zhì)譜分析結(jié)果表明,該重組蛋白的一級結(jié)構(gòu)與所設(shè)計的DNA序列編碼的氨基酸序列一致。ProteinA親和層析柱進(jìn)行純化,得到高純度的融合蛋白CRD2-TACI-Fc。 (4)純化的融合蛋白進(jìn)行CCK-8檢測,結(jié)果表明CRD2-TACI-Fc和TACI-Fc融合蛋白可以阻斷APRIL對Raji B細(xì)胞系的促增殖作用,并且CRD2-TACI-Fc較TACI-Fc的阻斷作用強。 本項研究為進(jìn)一步探討SLE等自身免疫疾病的發(fā)病機制和生物學(xué)治療方法奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:B lymphocyte stimulator (BLyS), also known as tumor necrosis factor family B cell-activating factor belonged to family (BAFF), is an important member of tumor necrosis factor superfamily. Value-added inducible ligands (APRIL, also known as TALL-2TRDL-1 and TNFSF-13) have 33% homology with BAFF protein sequences. Transmembrane protein activator (transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B cell maturation antigen (B cell maturation antigen, BCMA) are the common receptors of APRIL and BAFF. In this paper, we have cloned the CRD2 gene of human TACI extracellular domain. Based on the crystal structure of receptor and FC, we have used computer simulation technique, molecular docking method. The yeast expression vector -pPIC9K-CRD2-TACI-IgGFcwas constructed, and the recombinant CRD2-TACI-Fc fusion protein was induced and expressed. The biological activity of recombinant CRD2-TACI-Fc fusion protein was identified after purification. The aim of this study is to lay a foundation for further study on the interaction between BLyS / APRIL and its receptors and for the development of BLyS / APRIL antagonists for the treatment of autoimmune diseases. The main results of this study are as follows: (1) the extracellular domain CRD2 gene encoding human TACI was cloned successfully by PCR. The results of sequencing were consistent with those of GenBank. (2) the amplified extracellular domain of TACI, CRD2, was ligated with TACI-Fc gene and inserted into eukaryotic expression plasmid pPIC9K. The recombinant eukaryotic expression plasmid pPIC9K-CRD2-TACI-IgGFc. (3) the recombinant plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115. After methanol induction and optimization of the induction conditions, a high level of expression. SDS-PAGE analysis showed that the target band. Western Blot at 46kDa showed that the protein reacted positively with anti-TACI antibody. Mass spectrometry analysis of the protein sequence showed that the primary structure of the recombinant protein was consistent with the amino acid sequence encoded by the designed DNA sequence. The protein A affinity chromatography column was used to purify the recombinant protein. The purified fusion protein CRD2-TACI-Fc. (4) was detected by CCK-8. The results showed that CRD2-TACI-Fc and TACI-Fc fusion proteins could block the proliferation of Raji B cell line induced by APRIL, and CRD2-TACI-Fc was stronger than TACI-Fc. This study lays a foundation for further study of pathogenesis and biological therapy of autoimmune diseases such as SLE.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2131359