發(fā)布時間：2018-07-16 21:43

【摘要】：背景和目的 細菌性感染是感染性疾病中最常見的類型,如果沒有及時有效的治療,嚴重細菌感染可以導致高死亡率�？股厥侵委熂毦腥拘约膊∽钣行У奈淦�,然而隨著抗生素的濫用,細菌的耐藥性問題日益加劇,抗生素的殺菌作用受到嚴峻挑戰(zhàn)。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)等多重耐藥菌是醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌,其超強耐藥性常常導致高死亡率。近年來出現(xiàn)的所謂“超級細菌”,就是以大腸桿菌和克雷伯氏菌為主的多重耐藥菌,這些多重耐藥菌因攜帶一種新的內酰胺酶NDM-1(新德里金屬β內酰胺酶)基因,使細菌對現(xiàn)今除了替加環(huán)素(Tigecycline)和粘菌素(Colistin)以外幾乎所有類型的抗生素產(chǎn)生抗性,往往導致感染者不治身亡,因此需要尋找新的可代替抗生素的殺菌物質進行耐藥菌感染的治療及細菌感染的預防以減少抗生素的使用控制耐藥菌的發(fā)展。 噬菌體是自然界中廣泛存在的細菌病毒,幾乎有細菌生存的生境中就存在相應的噬菌體,例如海水、土壤、人畜類腸道等�；钍删w治療細菌性感染的早期研究及近幾年的動物試驗和初步臨床試驗,以及利用噬菌體裂解酶治療細菌性感染的最新研究,表明噬菌體及噬菌體裂解酶是潛在的可替代抗生素進行多重耐藥菌感染預防和治療的新型殺菌物質。作為細菌的天然殺手,噬菌體在細菌性感染尤其是多重耐藥菌感染的治療方面具有抗生素無法比擬的優(yōu)勢:噬菌體可依賴體內的宿主進行復制,因此僅需很小的劑量即可達到治療目的;噬菌體比抗生素專一性強,對機體正常的微生物群落影響很小,且不會感染人類細胞,其副作用較小;噬菌體可用于對抗生素過敏的患者;噬菌體可單獨使用也可結合抗生素使用以減少抗性菌的出現(xiàn);雖然致病菌為了逃避噬菌體的識別也會發(fā)展抗性,但優(yōu)于抗生素的是,噬菌體也會隨致病菌的變異而發(fā)生變異,并產(chǎn)生能裂解突變細菌的新噬菌體。噬菌體裂解酶的優(yōu)勢也很多:噬菌體裂解酶可高度純化,擁有極高的底物特異性;誘導機體產(chǎn)生的抗體不足以中和其裂解活性;由于不需要感染和復制,因此能更快地發(fā)揮殺菌作用;最后因其擁有不同的結構域和功能域分別進行細胞壁的結合和裂解,細菌不易對其產(chǎn)生抗性。 噬菌體在自然界中廣泛存在,但已分離并進行詳細研究的噬菌體數(shù)量為數(shù)很少,而為保證噬菌體使用的安全性和可控性,需要對噬菌體各項特征進行詳細的掌握。此外,噬菌體不僅僅是菌種特異性的,更多時候是菌株特異性的,因此要實現(xiàn)利用噬菌體進行有效地預防和控制細菌感染,需要數(shù)量龐大的噬菌體儲存庫以篩選與目標菌匹配的噬菌體。 本研究中我們進行了大腸桿菌裂解性噬菌體的分離、種屬鑒定、生物學特性及基因組學特征的研究、噬菌體裂解酶的原核表達及重組蛋白菌內、外活性的檢測,豐富了已知噬菌體的數(shù)量,為噬菌體的應用奠定基礎,同時促進噬菌體基因組學和噬菌體復制、裝配機制的研究。 方法和結果 我們從不同地點收集環(huán)境污水樣本,以大腸桿菌8099為指示菌自醫(yī)院污水中分離出多株噬菌體,其中一株裂解性噬菌體(IME08)還能裂解大腸桿菌K12系列菌株以及6株臨床分離大腸桿菌,表明其裂解譜較廣,預示著其在預防和治療大腸桿菌感染方面存在著潛在的應用價值;用DNase I、RNase A和限制性內切酶處理該噬菌體的遺傳物質,鑒定出該噬菌體是雙鏈DNA噬菌體;通過隨機PCR擴增噬菌體基因組DNA的隨機片段并克隆測序后,在NCBI網(wǎng)站進行在線BLAST分析,根據(jù)BLAST結果我們推測該噬菌體是一株新的T4-like噬菌體;電鏡下該噬菌體具有二十多面體的頭部及長尾部,呈現(xiàn)典型的肌尾噬菌體科(Myoviridas)的噬菌體的形態(tài);綜合以上特征,我們可以確定該噬菌體隸屬于雙鏈DNA噬菌體下有尾噬菌體目(Caudovirales)、肌尾噬菌體科(Myoviridas)的T4-like噬菌體屬;通過隨機PCR和巢式PCR結合的兩輪PCR方法擴增出IME08的宿主識別基因g37和g38,克隆測序后進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)其宿主識別模式不同于T4,而更接近于T2和K3,由g37和g38共同決定其宿主識別;進一步的生物學特性研究表明噬菌體IME08的最佳感染復數(shù)為2,雙層板培養(yǎng)4 h后開始出現(xiàn)噬菌斑,7h后噬菌斑直徑達到最大,且噬菌斑邊緣清晰。從一步生長曲線中可以看出該噬菌體的潛伏期為25min,裂解期為15min,裂解量為65±1 pfu。 利用高通量測序技術獲得噬菌體的全部序列信息,經(jīng)拼接基因組長17,253 bp,注釋后得到253個開放讀碼框(ORFs)和3個tRNA,不包含任何已知的抗生素抗性基因和毒力基因,具有潛在的應用價值;噬菌體IME08與模式生物T4噬菌體的基因組進行同源比對后,發(fā)現(xiàn)其基因組在基因組成和結構上,與生命周期相關的大部分必需基因是高度保守的,同時存在一些非必需基因的缺失、重復等變異;以重要的頭部蛋白gp23為分子標尺構建進化樹,發(fā)現(xiàn)噬菌體IME08與JS98和JS10具有最高同源性,屬于大腸桿菌T4-like噬菌體中的JS98子群。將IME08與JS98進行全基因組同源比對后發(fā)現(xiàn),2個噬菌體中絕大部分ORFs具有高度同源性,但IME08的宿主識別基因g37和g38和JS98的差異較大,反而與T2的同源性很高,推測IME08與T2在感染同一宿主時發(fā)生了基因的橫向遷移;在對測序數(shù)據(jù)進行分析的過程中,一些reads出現(xiàn)的頻率異常高,稱為高頻序列(high frequency sequences, HFSs)。經(jīng)分析這些HFSs的存在與噬菌體基因組末端有關。進一步分析發(fā)現(xiàn)HFSs上游存在一個保守序列5'-TGGA↓G-3',因此我們推測該噬菌體的基因組末端應該是經(jīng)過序列特異性酶切產(chǎn)生的,從而否定了過去T4-like噬菌體末端序列隨機的觀點,說明T4-like噬菌體的末端酶(terminase)具有序列特異性的識別和切割傾向。 為了研究該噬菌體裂解蛋白作為殺菌物質的潛力,我們利用冷休克表達載體pCold,成功地在大腸桿菌中表達了噬菌體IME08的2個裂解酶:內部裂解酶lysin和外部裂解酶gp5�；钚詸z測實驗結果顯示lysin和gp5均具有菌內裂解活性,但菌外裂解活性實驗得到了陰性的結果,造成這一結果的主要原因是革蘭氏陰性菌細胞壁外有一層厚厚的外膜,阻止了裂解酶與其底物即細胞壁的直接接觸;對于穿孔素holin來說,雖未得到其表達產(chǎn)物,但同樣證實了其破壞細胞膜的活性。
[Abstract]:Background and Purpose

Bacterial infection is the most common type in infectious diseases , and if there is no timely and effective treatment , severe bacterial infection can lead to high mortality rate . With the abuse of antibiotics , the drug resistance of bacteria is becoming more and more serious . The so - called " super - bacteria " appeared in recent years .

Bacteriophages are widely available in nature , and there are corresponding ages in the habitat of bacteria , such as seawater , soil , human and animal intestinal tract , etc . The phage display can be used alone or in combination with antibiotics to reduce the appearance of resistant bacteria .

In addition , phage can be used to effectively prevent and control bacterial infection , and a large number of phage repositories are needed to screen the phage matching the target bacteria .

In this study , we carried out the separation , identification , biological characteristics and genomics of E . coli lytic phage , the prokaryotic expression of phage lysate and the detection of the internal and external activity of recombinant protein bacteria , which enriched the number of known phage , laid the foundation for the application of phage , and promoted the research of phage gene group and phage replication and assembly mechanism .

Methods and Results

coli 8099 was used as the indicator to isolate the phage from the hospital sewage . The phage was amplified by random PCR and nested PCR . The results showed that the phage was a new T4 - like phage . The phage was identified as a new T4 - like phage under electron microscope . The phage was identified by the following features : the incubation period of phage IME08 was 25min , the cleavage period was 15min , and the lysate was 65 鹵 1 .

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本文編號：2127756