【摘要】：[目的]單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是重要的革蘭氏陽(yáng)性食源性致病菌,易在食品以及各種食品加工、運(yùn)輸和保藏設(shè)備的接觸面形成生物被膜,從而具有更強(qiáng)的抗逆性而難以徹底清除,因此成為食品衛(wèi)生安全的重要隱患。PrfA是LM在侵染宿主細(xì)胞時(shí)毒力基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的最重要的調(diào)控因子,而SigB是LM抵御外界不良環(huán)境時(shí)主要的壓力應(yīng)答因子,由于尚未有文獻(xiàn)直接把PrfA和SigB--這個(gè)LM中調(diào)控絕大多數(shù)毒力基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的重要的蛋白因子和壓力應(yīng)答因子,與LM在宿主外的一種重要存在形式--生物被膜聯(lián)系起來(lái),所以我們的研究將為深入研究LM致病機(jī)理提供新的視點(diǎn)。 [方法]本文的實(shí)驗(yàn)方法可以主要分為三部分。一、對(duì)LM野生株(EGD)、基因缺失菌株(EGDeΔprfA, EGDeAsigB、EGDΔprfAΔsigB)和無(wú)害李斯特菌(LI)在BHI培養(yǎng)基比較了各菌株生物被膜形成能力的差別。二、對(duì)PrfA的研究本文主要通過(guò)兩組對(duì)比實(shí)驗(yàn)即：1)在常用BHI培養(yǎng)基中,比較研究LM野生株(EGD和EGDe)、PrfA缺失株(EGDΔprfA和EGDeΔprfA)、無(wú)害李斯特菌(Listeria innocua, LI)、攜帶組成性表達(dá)PrfA蛋白的重組無(wú)害李斯特菌(LI-pERL3-prfA*)以及重組單核細(xì)胞增生李斯特菌(EGDeΔprfA-pERL3-prfA*),在生物被膜形成能力方面差異；2)比較研究LM野生株EGDe、PrfA缺失株EGDeΔprfA、以及攜帶組成性表達(dá)PrfA蛋白的重組單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDeAprfA-pERL3-prfA*在不同碳源的培養(yǎng)基中,BHI(Brain Heart Infusion,復(fù)雜多糖作為碳源)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Minimal Essential Medium簡(jiǎn)稱(chēng)MM培養(yǎng)基,可添加PTS糖或非PTS糖作為碳源,本文采用的PTS糖為葡萄糖,非PTS糖為甘油)中生物被膜形成的差異,探討LM重要的毒力調(diào)控蛋白PrfA在不同的糖成分作為碳源的培養(yǎng)基中對(duì)生物被膜形成的影響；三、比較了三種菌株LM野生株EGD、sigB缺失株EGDeAsigB和無(wú)害李斯特菌(Listeria innocua, LI)分別在BHI培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基添加0.3%膽汁酸鹽的培養(yǎng)基中,生物被膜形成能力的差異。 [結(jié)果]1)LM野生株具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力,而LI形成生物被膜的能力最弱;PrfA和SigB的缺失均能降低LM生物被膜的形成能力;2)在營(yíng)養(yǎng)豐富的常用BHI培養(yǎng)基中,組成性高量表達(dá)PrfA蛋白可以回復(fù)EGDeAprfA的生物被膜形成能力,但對(duì)LI沒(méi)有增強(qiáng)作用。在不同糖類(lèi)作為碳源的培養(yǎng)基中,各菌株在MM培養(yǎng)基中的被膜形成能力要顯著性高于在BHI培養(yǎng)基中相應(yīng)菌株的被膜形成能力；但無(wú)論在何種培養(yǎng)基中LM野生株(EGD或EGDe)均具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力,PrfA的缺失均能降低LM生物被膜的形成能力；只是在BHI培養(yǎng)基中組成性高量表達(dá)PrfA蛋白可以回復(fù)EGDeAprfA的生物被膜形成能力；而在MM培養(yǎng)基中高量表達(dá)PrfA蛋白不能回復(fù)EGDeΔprfA的生物被膜形成能力,并且在以葡萄糖為唯一碳源的MM培養(yǎng)中,高表達(dá)PrfA菌株的生物被膜形成能力甚至比EGDeΔprfA還要低；3)EGD、EGDeAsigB和LI三種菌株無(wú)論在填不添加0.3%的膽汁酸鹽的BHI培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出：LI的被膜形成能力最差(幾乎沒(méi)有交聯(lián)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn))低于EGDeAsigB低于EGD的被膜形成能力,區(qū)別在于：在添加0.3%膽汁酸鹽后,EGD的被膜形成能力較BHI中要提高一些,而EGDeAsigB卻較BHI中被膜形成能力要降低一些,LI幾乎不受影響。 [結(jié)論]1)LM在營(yíng)養(yǎng)極端貧乏的MM培養(yǎng)基(無(wú)論添加PTS糖還是非PTS糖)中生物被膜的形成能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在營(yíng)養(yǎng)十分豐富的BHI培養(yǎng)基。但無(wú)論在哪種培養(yǎng)基中,PrfA均在LM生物被膜形成中具有重要的促進(jìn)作用,缺失該基因均可降低LM的生物被膜的形成能力,但這種促進(jìn)作用與培養(yǎng)基的成分(我們認(rèn)為主要是糖成分不同)、PrfA數(shù)量與活性均有密切的關(guān)系。2)0.3%的膽汁酸鹽可以在一定程度上促進(jìn)LM的被膜形成,卻不能促進(jìn)EGDeAsigB的被膜形成,反而使其被膜形成的能力略有下降,表明：LM中對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗能力一定程度上依賴(lài)于SigB因子,所以不利于細(xì)菌生存的外界條件可以在一定條件下通過(guò)調(diào)節(jié)SigB因子,而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而通過(guò)促進(jìn)被膜的形成在一定程度上協(xié)助LM對(duì)抗不良環(huán)境。
[Abstract]:It is an important factor to control the expression of virulence genes in the host cells , and SigB is the most important factor for the expression of virulence genes in host cells .

In this paper , the differences of biofilm formation ability of different strains were compared between two groups : EGD , EGD , EGD and EGD .
2 ) The effect of LM on membrane formation in medium containing glucose and non - PTS sugar as carbon source was investigated .
Thirdly , the differences in the ability of biofilm formation were compared between EGD , sigB deletion strain EGD , sigB deletion strain EGDeAsigB and virulent innocua , LI in the medium supplemented with 0.3 % bile acid salt in BHI medium and BHI medium respectively .

( 1 ) LM wild strain has stronger ability of biofilm formation , but the ability of LI to form biofilm is the weakest , and the deletion of PrA and SigB can reduce the ability of the membrane formation of LM biofilm , but it has no enhancement effect on LI .
However , no matter what culture medium LM wild plant ( EGD or EGDe ) had stronger ability of biofilm formation , the deletion of PrA could reduce the ability of LM biofilm formation ;
Only in BHI medium the constitutive high expression Prin protein can respond to the biofilm formation ability of EGDeApra .
whereas in MM culture medium the high expression of Prin protein could not respond to the biofilm formation ability of EGDe . DELTA.prf , and in MM culture with glucose as the sole carbon source , the biofilm formation ability of the high - expression PrG strain was even lower than that of EGDe .
3 ) EGD , EGDeAsigB and LI showed that LI had the worst film formation ability ( almost no cross - linked structure ) than EGD in the BHI medium supplemented with 0.3 % bile acid salt . The difference was that after the addition of 0.3 % bile acid salt , the film formation ability of EGD was higher than that in BHI , while EGDeAsigB was less capable of being formed in BHI than in BHI , and LI was almost unaffected .

Conclusion : ( 1 ) The ability of LM to form the membrane is much higher than that in the nutrient - rich MM culture medium ( whether the PTS sugar is added to non - PTS sugar ) . However , the ability of the membrane to form the LM can be reduced to some extent .
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2118893