本文選題：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 + CHOP　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是嚴(yán)重創(chuàng)傷、擠壓綜合征以及多種疾病所導(dǎo)致的臨床急危重癥,一旦發(fā)生急性腎衰竭(acute renal failure,ARF),死亡率高達(dá)40%～60%。缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)是急性腎損傷的重要原因之一,炎癥反應(yīng)是缺血再灌注引起急性腎損傷的重要機(jī)制。腎小管上皮細(xì)胞作為缺血再灌注損傷關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,是腎組織炎癥介質(zhì)的主要來源。核因子-κB(nuclear factorκB, NF-κB)是調(diào)控炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在引發(fā)炎癥瀑布效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。盡管研究發(fā)現(xiàn)NF-κB與急性I/R腎損傷炎癥發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系,但抑制其活性并不能完全阻斷腎組織炎性損傷。因此,進(jìn)一步揭示I/R引起腎組織炎癥反應(yīng)失控的途徑,對探明急性腎損傷發(fā)生機(jī)制和制定新的防治措施具有重要意義。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的細(xì)胞器,對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起重要作用。缺氧、低糖以及能量匱乏等因素均可引起過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。已證實(shí),過度ERS不僅是缺血性心、腦組織損傷的重要機(jī)制,也與急、慢性炎癥疾病密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn),I/R可引起腎組織過度ERS,但其在缺血再灌注腎損傷中的作用與機(jī)制尚不明確。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子,屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員,它是ERS信號途徑中調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子。最新研究發(fā)現(xiàn),急性肺炎、胰腺炎和結(jié)腸炎動(dòng)物模型中,chop基因敲除小鼠caspase-11 mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少、caspase-1活性顯著降低、巨噬細(xì)胞和炎癥細(xì)胞TNF-α和IL-1β浸潤明顯減少,提示CHOP-炎性caspase途徑在急性炎癥疾病中具有重要作用。已證實(shí),IL-1β是炎癥反應(yīng)早期產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子,炎性caspase負(fù)責(zé)剪切IL-1β前體成為成熟的IL-1β,而活化的IL-1β反過來通過激活NF-κB放大炎癥瀑布效應(yīng)。據(jù)此,我們推測,CHOP通過炎性caspase途徑在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IL-1β活化可能是缺血再灌注腎損傷炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。 本課題通過建立大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E的缺氧復(fù)氧(hypoxia reoxygenation,H/R)損傷模型,探明CHOP-caspase途徑在缺血再灌注腎損傷炎癥反應(yīng)中的作用與機(jī)制,為闡明急性缺血性腎損傷發(fā)生機(jī)制以及尋找新的治療策略提供科學(xué)依據(jù)。 一、實(shí)驗(yàn)方法 1.細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)用含5%胎牛血清的DMEM液于37℃、5%CO2和95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2.缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型的制備 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)95%時(shí)用無血清DMEM同步化細(xì)胞24 h,換用無血清無抗生素磷酸鹽緩沖液于37℃、含有1%(體積分?jǐn)?shù))O2+94% N2 +5%CO2混合氣的37℃缺氧箱(Modular Incubator Chamber)中缺氧4 h。復(fù)氧時(shí),將培養(yǎng)液換為正常培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2+95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1、3、6、12、24 h,收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清。 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染 NRK-52E以105/孔傳代于六孔板,培養(yǎng)于含5%FBS不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)至密度達(dá)50%-60%。分別以5μL脂質(zhì)體Lipofecta mine? 2000加8μL對照siRNA或8μL CHOP siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞24 h,進(jìn)行缺氧復(fù)氧12 h。采用RT-PCR和Western blot方法評價(jià)轉(zhuǎn)染效率。 4.細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為兩大組:正常對照組、H/R1 h組、H/R3 h組、H/R6 h組、H/R12 h組、H/R24 h組;正常對照組、對照siRNA組、CHOP siRNA組、H/R12 h組、對照siRNA+H/R12 h組和CHOP siRNA + H/R12 h組。 5.檢測指標(biāo)與方法 5.1細(xì)胞活力測定 常規(guī)生化方法測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)的含量。 5.2 RT-PCR法檢測細(xì)胞caspase-11、caspase-1以及IL-1βmRNA表達(dá)水平 TRIZOL法提取各組細(xì)胞總RNA ,在20μL反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以cDNA為模板,進(jìn)行核酸定量。以β-actin作為內(nèi)參對照,引物序列如下:chop上游5'GGGAAACAGCGCATGAAGGA3',下游5'GCGTGATGGTGCTGGGTACA3' ,擴(kuò)增產(chǎn)物為221 bp ; caspase-11上游5'ACGGCTGAGGGCATGGAATC3' ,下游5'AGGCCTGCACAATGATGACTTT3' ,擴(kuò)增產(chǎn)物為235 bp ; caspase-1上游5'TCGGGAGTATGGGAAGGTTGAG 3',下游5'TCCCTTATCCAAAATGCATGCTA 3',擴(kuò)增產(chǎn)物為290 bp ; IL-1β上游5'CGTGGCACATTCTGGTCAAA3' ,下游5'CTCGTGACCCCCCTGAATC3'擴(kuò)增產(chǎn)物為220 bp ;β-actin上游5'ACCCCGTGCTGCTGACCGAG3',下游5'TCCCGGCCAGCCAGGTCCA3',擴(kuò)增產(chǎn)物為249 bp。采用20μL反應(yīng)體系在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃5 min后,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng):變性94℃30 s ,退火57℃30 s ,延伸72℃45 s。對PCR反應(yīng)過程中每一循環(huán)熒光信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,獲得Ct (cycle threshold)值。采用RT-PCR相對定量方法對2 -ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 5.3 Western blot法檢測GRP78、CHOP、caspase-11、caspase-1以及IL-1β蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞,提取蛋白,考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度。將含有50μg總蛋白的提取液與4×SDS加樣緩沖液混勻, 100℃加熱7 min變性,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h ,加入一抗GRP78(1:1 000)、CHOP(1:200)、caspase-11(1:200)、caspase-1(1:1000)、IL-1β(1:200),4℃過夜;TBST緩沖液漂洗10 min×3次;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1:1 0 000),室溫孵育1 h ;TBST緩沖液漂洗6 min×5次后,暗室中加ECL發(fā)光試劑(Pierce公司),X光膠片曝光,常規(guī)方法顯影、定影。凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參照,GRP78、CHOP、caspase-11、caspase-1、IL-1β蛋白含量分別用GRP78/β-actin、CHOP/β-actin、caspase-11/β-actin、caspase-1/β-actin、IL-1β表示。 5.4 ELISA檢測IL-1β的表達(dá) 采用ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-1β水平。 5.5細(xì)胞免疫熒光檢測腎小管上皮細(xì)胞CHOP和caspase-11的表達(dá) 收集細(xì)胞,PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片30 min, PBS漂洗3次,每次5 min; 0.25% triton X-100破膜10 min,PBS漂洗3次,每次5 min;用CHOP、caspase-11抗體分別孵育或共同孵育,4℃過夜;第2 d PBS漂洗3次,每次5 min;分別用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1:20)或Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:50) 37℃孵育1 h, PBS漂洗3次,每次5 min; DAPI染液染細(xì)胞核3 min,PBS漂洗3次,每次5 min;封片劑封片。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并照相。 二、結(jié)果 1. H/R引起腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷與過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系 1.1 H/R引起腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷 細(xì)胞損傷變化:與對照組相比,細(xì)胞上清LDH水平于H/R1 h開始增加,于復(fù)氧12 h達(dá)高峰,復(fù)氧24 h開始下降但仍高于對照組(P 0.05)。 細(xì)胞上清活性IL-1β表達(dá)變化:與對照組相比,H/R1 h后細(xì)胞上清IL-1β水平開始增加,于復(fù)氧12 h達(dá)高峰,復(fù)氧24 h開始下降但仍高于對照組(P 0.05)。 1.2 H/R后腎小管上皮細(xì)胞GRP78、CHOP的表達(dá)變化 GRP78表達(dá)變化:H/R后1 h開始升高,12 h達(dá)到峰值,24 h開始下降,但仍高于對照組水平(P 0.05)。 CHOP表達(dá)變化:對照組CHOP有基礎(chǔ)水平表達(dá),H/R1 h時(shí)開始增加,H/R6 h時(shí)顯著增多,H/R12 h達(dá)峰值,H/R24 h開始下降但仍高于對照組水平(P 0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示,對照組腎小管上皮細(xì)胞CHOP位于細(xì)胞漿,表達(dá)量較低,H/R12 h后CHOP位于細(xì)胞核,表達(dá)量明顯增多。 2. H/R對腎小管上皮細(xì)胞CHOP、炎性caspase、IL-1β表達(dá)的影響 2.1 H/R后腎小管上皮細(xì)胞caspase-11、caspase-1、IL-1β的表達(dá)變化 Caspase-11、caspase-1以及IL-1β表達(dá)變化:對照組caspase-11、caspase-1、IL-1β前體均有基礎(chǔ)水平表達(dá),H/R1 h時(shí)開始增加,H/R6 h時(shí)顯著增多,H/R12 h達(dá)峰值,H/R24 h開始減少;活性caspase-11、caspase-1、IL-1β在H/R1 h時(shí)開始增加,H/R12 h達(dá)峰值,H/R24 h開始減少但仍高于對照組水平(P 0.05)。 2.2 H/R后腎小管上皮細(xì)胞CHOP和caspase-11時(shí)空表達(dá)變化 正常情況下,CHOP和caspase-11位于腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞漿,有基礎(chǔ)水平表達(dá);H/R12 h時(shí),CHOP表達(dá)增加且發(fā)生核轉(zhuǎn)位,caspase-11表達(dá)增加,兩者在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中共表達(dá)。 3. CHOP基因沉默對H/R腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷的影響 3.1 CHOP基因沉默顯著抑制CHOP的表達(dá) CHOP siRNA顯著抑制了腎小管上皮細(xì)胞CHOP mRNA、蛋白的表達(dá),抑制效率分別為60.38%、68.83%(P 0.05)。 3.2 CHOP基因沉默顯著減輕H/R腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷 細(xì)胞損傷變化:與H/R12 h組比較,CHOP siRNA顯著減輕缺氧復(fù)氧損傷后腎小管上皮細(xì)胞損傷,細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平明顯減少(P 0.05)。 細(xì)胞上清活性IL-1β表達(dá)變化:與H/R12 h組比較,CHOP基因沉默后H/R12 h細(xì)胞培養(yǎng)上清中活性IL-1β水平明顯減少(P 0.05)。 4. CHOP基因沉默對腎小管上皮細(xì)胞H/R損傷后GRP78、CHOP、炎性caspase以及IL-1β表達(dá)的影響 CHOP siRNA顯著抑制H/R誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞CHOP蛋白的表達(dá)(P 0.05),對GRP78蛋白表達(dá)無明顯影響。 CHOP基因沉默可顯著抑制H/R12 h腎小管上皮細(xì)胞caspase-11 mRNA和蛋白的表達(dá)(P 0.05)、減少活化的caspase-1和IL-1β蛋白水平(P 0.05,P 0.05)。提示CHOP基因沉默能通過抑制炎癥caspase通路的活化,顯著減輕腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),減輕細(xì)胞損傷。 三、結(jié)論 缺氧復(fù)氧可以激活腎小管上皮細(xì)胞過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,活化CHOP放大炎癥瀑布效應(yīng)。CHOP通過炎性caspase途徑在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IL-1β的產(chǎn)生,在急性缺血性腎損傷炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2117067