本文選題：肽聚糖 + 模擬肽��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2011年博士論文

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)是一種可寄居在人體皮膚和粘膜部位的革蘭陽性菌(G+菌),是社區(qū)和院內(nèi)感染的主要病原體。當各種原因?qū)е旅庖叩拖禄蛉毕�、異位寄生、菌群失調(diào)時可引起如高死亡率的膿毒血癥等嚴重后果。自20世紀60年代首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林的菌株以來(MRSA),各種耐藥菌株陸續(xù)出現(xiàn),使臨床用藥面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)；在應對上述挑戰(zhàn)中,人們對興起于20世紀60年代的金葡菌免疫防治寄予希望。但真正將免疫治療、預防及應急預防用于臨床仍有很多的難題需解決。目前國內(nèi)外用于研發(fā)金葡菌疫苗的主要成份包括：金葡菌減毒活疫苗、莢膜多糖—蛋白連接疫苗(StaphVAX, PentaStaph)和毒素(a-hemolysin、PVL、TSST-1等)疫苗；葡糖胺(PNAG、PNSG)和表面蛋白(IsdA,IsdB,SdrD and SdrE)疫苗；和DNA疫苗FnBPA-CIfA等。雖部分被批準進入臨床實驗,但尚無一被批準臨床應用。 肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)是金葡菌細胞壁的重要成份,近年更是被稱為是細菌的“阿喀琉斯之踵”,意為強者的致命弱點,是免疫防治的靶抗原。但至今未被作為疫苗候選靶點的主要原因在于：PGN為非蛋白抗原,即TI抗原(胸腺非依賴抗原),免疫原性弱,即便是感染個體其抗體滴度也不高。本研究嘗試用短肽模擬PGN抗原表位,將其抗原性質(zhì)由TI抗原改變?yōu)門D(胸腺依賴抗原)抗原,以誘導有效的再次免疫應答,探索以模擬肽作為疫苗候選的可能性。 已知,短肽可模擬蛋白與非蛋白(糖、脂等)表位,常用于構(gòu)象性表位特性以及糖脂類抗原表位研究。近十余年來,已在研究病原生物及腫瘤的非蛋白成份方面做了大量探索,并可用于分析蛋白質(zhì)折疊中形成非連續(xù)性表位的特點。合成肽疫苗的優(yōu)勢是對有效與非必要抗原表位的組合與取舍,而缺點則是免疫原性弱,需設計合適的載體與佐劑。但近年國內(nèi)的多價抗原肽(Multiple Antigenic Peptide,MAP)技術(shù)有了長足的發(fā)展,其優(yōu)勢體現(xiàn)在：不需交聯(lián)載體,可不用佐劑；除抗體反應,還可誘導CTL與Th細胞反應；尤其在不同的分枝上可有不同序列的肽鏈,可用于構(gòu)成或模擬更為復雜或不同功能的表位。國外近年已有數(shù)個多價肽疫苗進入臨床觀察。 本課題的主要研究思路是：利用噬菌體肽庫篩選獲得的短肽模擬PGN的保守性結(jié)構(gòu)表位,將其非蛋白抗原表位的性質(zhì)改變?yōu)槎屉?由此使TI-Ag改變?yōu)門D-Ag；并以所獲模擬肽序列合成四分枝多價抗原肽(MAP)作為疫苗候選誘導機體內(nèi)產(chǎn)生有效的再次抗體應答和保護性免疫。 本課題組用抗PGN商品化單抗從噬菌體隨機展示肽庫中篩選了十余個模擬位克隆,結(jié)合生物信息學分析選擇三個PGN表位的序列進行修飾與合成,并進行體外間接ELISA與抑制ELISA鑒定,從中選擇效果較好的SP31進行四分枝多價抗原肽,并對其免疫原性及免疫效果進行評價。 一、應用噬菌體展示技術(shù)篩選金葡菌PGN模擬肽克隆 從噬菌體線性肽庫中篩選可模擬PGN表位的噬菌體克隆以商品化抗PGN單克隆抗體為靶分子對噬菌體線性12線性肽庫進行了3輪篩選,富集率達為2千倍以上,顯示了明顯的富集效果；從第三輪隨機挑選49噬菌體克隆中用夾心ELISA鑒定出可與抗PGN單克隆抗體結(jié)合的14個克隆。 陽性噬菌體測序及序列分析將上述14個陽性噬菌體克隆進行DNA測序,并對其氨基酸序列進行分析,其第31、28、43號克隆具有共同序列：ATWxHxLxSAGL,并與27、39、1序列有保守序列xHx或Hx,除噬菌體克隆1號外與anti-PGN McAb均有高反應性(OD450),第5、23、38、44雖具有共同序列GWWPYAALRALS,但多次重復后第5序列非特異性結(jié)合較高,可能含有吸板序列：因此,選擇31,27,39三種噬菌體作為后續(xù)研究對象。 二、PGN模擬肽的設計、合成與體外鑒定 陽性克隆展示序列抗原特性分析通過在線軟件www.syfpeithi.de, http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl, http://www.darrenflower.info/mhcpred預測和T細胞表位預測軟件(DNAstar)分析發(fā)現(xiàn),三種陽性噬菌體展示序列均具有人和鼠MHC結(jié)合表位；其中No.31可能的抗原表位為-TWxHxLx-序列,在兩端分別加上SG-、GG后可能具有T細胞表位；No.27可能的抗原表位為—SPHxH000RS-,在兩端加上SG/G GG的不同組合后均不具有T細胞表位；No.39可能的抗原表位為-WxHxVxW-;在兩端加上不同SG/A GG氨基酸后可能具有T細胞表位,序列分析結(jié)果表明三種序列具有構(gòu)成Th、B細胞表位的特性。但是否真正模擬PGN的抗原表位,還需進一步的生物實驗驗證。 PGN模擬肽抗原性鑒定體外ELISA鑒定結(jié)果表明,以生物素標記三種線性合成肽鏈(SP31,SP27,SP39)能特異結(jié)合抗PGN單抗及兔抗S.aureus全菌多抗(FSP31=1139.058, PSP31=0.000; FSP27=196.091, PSP27=0.000; FSP39=90.811,PSP39=0.000),其中SP31、SP27與抗PGN單抗的反應性優(yōu)于抗S.aureus多抗,而SP39則反之；抑制實驗表明,PGN能劑量依賴地抑制SP31、SP27與抗PGN單克隆抗體結(jié)合(FPGN抑制SP31=729.036,PPGN抑制SP31=0.027；FSP31抑制PGN=12.286,P SP31抑制PGN=0.039；FPGN抑制SP27=74.776,PPGN抑制SP27=0.001),抑制效果在40%-60%,而39號合成肽抑制效果較差,量效關(guān)系不顯著(數(shù)據(jù)未在文中顯示)。上述結(jié)果提示SP31,SP27,SP39線性肽可不同程度地模擬PGN表位的抗原性�；赟P31,SP27為模板合成四分枝多價抗原肽(MAP)鑒定表明,MAP-P31劑量依賴地與抗PGN單抗(F=2021.727,P=0.000)和抗S.aureus多抗反應(F=178.344,P=0.000),并能與PGN相互抑制與抗PGN McAb的反應(FPGN抑制MAP-P31=64.032,PPGN抑制MAP-P31=0.015,FMAP-P31抑制PGN=17.532,PMAP-P31抑制PGN=0.053),而MAP-P27僅與抗S.aureus多抗反應；由此我們以MAP-P31作后續(xù)的免疫原性研究。 PGN模擬肽對小鼠腹腔巨噬細胞(M9)刺激作用實驗結(jié)果表明MAP-P31模擬肽能顯著刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子TNFα、IL-6(FrNFα=1265.415,PTNFα=0.000；FIL_6=248.353,PIL-6=0.000),并呈一定的劑量依賴關(guān)系,但低于PGN刺激的細胞因子產(chǎn)生水平。該結(jié)果提示MAP-P31不但可模擬PGN表位的抗原性,亦可模擬其刺激巨噬細胞并產(chǎn)生細胞因子的生物學活性。 三、PGN抗原模擬肽MAP-P31主動免疫效果評價 不同免疫方式的效果評價以MAP-P31(無交聯(lián)載體)為免疫原,采用不同免疫方案免疫小鼠,二次免疫后一周檢測免疫血清效價。結(jié)果顯示：MAP-P31加弗氏佐劑乳化組效果顯著優(yōu)于基礎免疫組(弗氏佐劑提前一周注射,后續(xù)均用不含佐劑的MAP-P31進行免疫)、無佐劑組(P=0.001vs FCA prior to MAP-P31;P=0.005vsMAP-P31)。結(jié)果提示,MAP-P31免疫接種可以不需要交聯(lián)其他的蛋白載體,但仍需佐劑。該條件用于后續(xù)實驗。 抗血清免疫反應性評價合成肽MAP-P31加弗氏佐劑免疫小鼠的抗血清含可與PGN、MAP-P31以及S.aureus結(jié)合的IgG型抗體,并持續(xù)8周以上。提示MAP-P31可誘導小鼠產(chǎn)生了針對PGN和S.aureus的再次抗體應答與免疫記憶(FPGN=70.122,PPGN=0.000；FSaureus=379.255,PSaureus=0.000)。此外,抗MAP-P31抗血清尚可與金葡菌磷壁酸(LTA)有微弱反應,但與LPS不反應；并與表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大腸桿菌(E.coli)和銅綠假單胞菌(P. aeruginosus)的超聲裂解物反應(P0.05 vs anti-unrelated MAP),表現(xiàn)出一定的交叉反應性。提示MAP-P31可能模擬不同細菌PGN的共同或相似抗原表位。 抗血清的體外殺菌/抑菌及調(diào)理吞噬作用實驗結(jié)果表明,在補體存在或補體滅活情況下,抗MAP-P31抗血清對甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)均具有殺菌／抑制作用；并對腸球菌、人葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和嗜麥芽黃單胞菌均表現(xiàn)出一定的抑制／殺滅作用,然而對MRSA(ATCC43300)反而促進其生長作用,該結(jié)果提示血清殺菌作用及抗菌譜具有一定局限性,需進一步優(yōu)化序列結(jié)構(gòu),以期能產(chǎn)生廣譜的抗菌作用。研究結(jié)果亦證實在滅活補體后,抗MAP-P31血清仍能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞對FITC標記的甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)的吞噬作用(F=981.862,P=0.000)。 MAP-P31誘導的小鼠體內(nèi)保護作用小鼠尾靜脈注射亞致死劑量的甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)后,MAP-P31免疫組小鼠肝、脾、腎等主要臟器中細菌載量顯著低于無關(guān)MAP免疫對照組(Piver=0.018,Pspleen=0.015,Pkindey=0.020)；腹腔注射致死劑量的甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)后,MAP-P31免疫組2周后的生存率為90%,而PBS免疫組和無關(guān)MAP免疫組小鼠生存率分別為0%和20%,提示免疫MAP-P31免疫后小鼠產(chǎn)生了針對甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)的保護性免疫。 四、PGN模擬肽改造及其被動免疫效果評價 PGN模擬肽序列的改造鑒于MAP-P31免疫血清對MSSA菌殺菌作用明顯,而對MRSA則有促進其生長作用,我們對其進行了序列改造的嘗試。根據(jù)I)NAstar軟件預測,我們在MAP-P31的兩端延長序列中改變個別氨基酸使其形成Th細胞識別表位,合成四分枝多價抗原肽并命名為MAP-P31.1,以期獲得對MRSA有殺傷/抑制作用的序列。 MAP-P31.1免疫反應性鑒定以此MAP-P31.1加弗氏佐劑為免疫原免疫家兔和Balb/C小鼠,5次免疫后,其免疫血清可結(jié)合胰酶消化后PGN(?)S.aureus,提示其可能針對的是PGN的多糖表位,該模擬肽與PGN有相同或相似的抗原表位。MAP-P31.1免疫后,用熱滅活S.aureus做加強免疫可增強抗體效價10倍(P=0.002vs no boost),其可能的臨床應用價值在于：用合成肽疫苗接種后,自然感染S.aureus可能發(fā)揮加強免疫的作用。 MAP-P31.1抗血清殺菌/抑菌作用抗MAP-P31.1小鼠血清在有/無補體作用下對MRSA與MSSA均有顯著殺菌/抑菌作用(FMSSA(inactive complements)=16.490, PMSSA(inactive complements)=0.001;FMRSA (inactive complements)=13.213,PMRSA(inactive complements) =0.006;FMRSA (complements)=14.150,PMRSA(complements)=:0.005),且均顯著優(yōu)于anti-S.aureus多抗血清與抗MAP-P31血清(P0.001vs anti-S.aureus組；t=-8.302,P=0.001)。 MAP-P31.1免疫兔IgG的被動保護作用與正常兔IgG、抗S.aureus多抗對照組比較,純化抗MAP-P31.1 IgG抗體被動輸入能延長甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)攻擊小鼠的生存時間與生存率,MAP31.1保護組小鼠一周后生存率為60%,抗S.aureus與NS組均為0%,NRS組為20%；顯著增強小鼠主要臟器對MSSA清除率(Pliver=0.006 vs NRS, Pspleen=0.013 vs NRS,Pkidey=0.010 vs NRS)。該結(jié)果提示MAP-P31.1免疫兔IgG對S.aureus具有一定的保護效果；遺憾的是該抗MAP-P31.1純化IgG對甲氧西林耐藥菌株(MRSA)仍無保護作用。隨后的清除實驗表明正常兔IgG和MAP-P31.1免疫純化IgG與MRSA(ATCC43300)混合靜脈注射后,抗MAP-P31.1組脾臟中細菌載量顯著降低(P=0.030vsNRS),肝臟中無顯著差異,該結(jié)果提示抗MAP-P31.1 IgG對MRSA可能具有一定保護作用。對于MSSA所致膿腫,MAP-P31.1注射組膿腫數(shù)量或大小明顯少于其余各組,提示MAP-P31.1有抑制MSSA型膿腫的形成；而對于MRSA所致膿腫,anti-S.aureus組膿腫數(shù)最多呈彌散分布,其余各組集中在邊緣；抗MAP-P31.1 IgG組膿腫數(shù)或面積雖然低于正常IgG和抗S.aureus IgG組,但與NS組比較無顯著差別,提示抗MAP-P31.1IgG對MRSA所致膿腫無明顯抑制作用。上述結(jié)果提示,對MAP-P31序列改造雖然顯示了一定的效果,如抗血清的體外殺菌活性,但對MRSA體內(nèi)攻擊仍不能形成有效的保護。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2101968