本文選題：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 + 肺動(dòng)脈瓣內(nèi)皮細(xì)胞　； 參考：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：(第一部分) 背景：血管鈣化是礦物質(zhì)代謝失調(diào)在心血管系統(tǒng)的表現(xiàn)。它以病變的動(dòng)脈壁及瓣膜中大量鈣質(zhì)的沉積和骨樣組織形成為標(biāo)志性病理改變,動(dòng)脈瓣膜是最容易受累的部位。瓣膜鈣化最初被認(rèn)為是一種老年退行性病變,現(xiàn)已證實(shí)是一個(gè)主動(dòng)的炎癥、增生和生物礦化的過程。新生微血管和骨樣組織形成在瓣膜鈣化早期的特征性表現(xiàn)提示了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF在瓣膜鈣化過程中的重要作用。 目的：探討VEGF是否能夠引起瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞鈣化及其可能的分子機(jī)制。 方法：取原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈瓣內(nèi)皮細(xì)胞,VEGF作用后,以fura-2檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)；熒光顯微鏡下觀察VEGF刺激后GFP-NFAT融合蛋白的核轉(zhuǎn)位；real-timePCR檢測(cè)BMP-2、cbfa1、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相關(guān)基因的表達(dá)；Von Kossa染色檢測(cè)細(xì)胞鈣化。 結(jié)果：100ng/ml VEGF的刺激激發(fā)了人肺動(dòng)脈瓣內(nèi)皮細(xì)胞中鈣振蕩的產(chǎn)生,頻率為0.3±0.03次/min,波寬80±3.5S,并引起NFAT快速的核轉(zhuǎn)位。BMP-2、cbfa1、 osteocalcin及osteoprotegerin的mRNA水平在刺激后6-24小時(shí)均顯著提高,并在48小時(shí)左右回落。刺激后72小時(shí),在培養(yǎng)單層細(xì)胞的基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)鈣化斑塊的出現(xiàn)。 結(jié)論：VEGF誘導(dǎo)瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞骨化相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞鈣化；這種作用與VEGF激發(fā)瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞鈣振蕩,進(jìn)而引發(fā)NFAT活化及核轉(zhuǎn)位有關(guān)。 (第二部分) 背景：Fluvastatin是一種他汀類藥物,是HMG-CoA還原酶的抑制劑,可通過與HMG-CoA還原酶的活性中心結(jié)合,阻斷甲羥戊酸代謝途徑,起到心血管保護(hù)作用。 目的：探討fluvastatin是否能夠抑制VEGF所造成的瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞鈣化及其與細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)間的關(guān)系。 方法：培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞以fluvastatin預(yù)先處理24小時(shí),再給予100ng/ml VEGF刺激,fura-2檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)；表達(dá)GFP-NFAT融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察VEGF刺激后GFP-NFAT的核轉(zhuǎn)位；real-time PCR檢測(cè)BMP-2、cbfa1、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相關(guān)基因的表達(dá)；Von Kossa染色檢測(cè)細(xì)胞鈣化。 結(jié)果：10nM fluvastatin的預(yù)處理抑制了瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞中鈣振蕩的產(chǎn)生及后繼的NFAT核轉(zhuǎn)位。BMP-2、cbfa1、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相關(guān)基因的mRNA水平分別降低了(50.61±10.88)%,(82.23±22.11)%,(85.58±19.03)%和(85.57±8.42)%。VEGF刺激后72小時(shí),在培養(yǎng)單層細(xì)胞的基質(zhì)中未見鈣化斑塊。 結(jié)論：fluvastatin有效抑制了VEGF所引起的瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞鈣化,且這種作用是通過其抑制細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)依賴的NFAT信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。 (第三部分) 背景：GGPP是除膽固醇以外被statins阻斷的另一類異戊二烯。研究提示statins的多種保護(hù)性藥理學(xué)作用均與對(duì)GGPP的合成阻斷,從而影響細(xì)胞中小G蛋白活性有關(guān)。 目的：探討fluvastatin抑制VEGF所致瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞鈣化的機(jī)制 方法：培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞以GGPP和fluvastatin共同預(yù)處理24小時(shí),再給予100ng/ml VEGF刺激,fura-2檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)；表達(dá)NFAT-GFP融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察VEGF刺激后NFAT的核轉(zhuǎn)位；real-time PCR檢測(cè)BMP-2、cbfal、osteocalcin及osteoprotegerin等骨形成相關(guān)基因的表達(dá)；Von Kossa染色檢測(cè)細(xì)胞鈣化。 結(jié)果：10nM的GGPP和fluvastatin共同預(yù)處理后,VEGF仍然可以誘導(dǎo)瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞中鈣振蕩的產(chǎn)生,頻率為0.074±0.02次／min,波寬65.7±8.8S,以及NFAT的核轉(zhuǎn)位。BMP-2、cbfal、osteocalcin及osteoprotegerin的mRNA水平較未補(bǔ)充GGPP前分別提高了1.88±0.16、8.44±3.56、6.59±3.7和2.34±0.16倍。VEGF刺激后72小時(shí),在培養(yǎng)的單層細(xì)胞基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)鈣化斑塊的出現(xiàn)。 結(jié)論：GGPP逆轉(zhuǎn)了fluvastatin對(duì)VEGF所致血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣化的抑制,說明本實(shí)驗(yàn)中fluvastatin對(duì)血管鈣化的保護(hù)作用是通過阻斷GGPP而實(shí)現(xiàn)。
[Abstract]:(Part I)
Background: vascular calcification is a manifestation of the metabolic disorder of the mineral in the cardiovascular system. It is a landmark pathological change in the lesions of the artery wall and a large number of calcium deposits and osteoid tissue in the valve. The artery valve is the most vulnerable part. Valve calcification is originally considered a degenerative disease of the elderly and has been proved to be a main disease. The important role of vascular endothelial growth factor VEGF in valve calcification is suggestive of the early characteristics of the formation of new microvascular and osteoid tissue in the early stage of valve calcification.
Objective: To investigate whether VEGF can induce calcification of valve endothelial cells and its possible molecular mechanism.
Methods: the cultured human pulmonary artery valve endothelial cells were cultured. After VEGF action, the intracellular calcium signal was detected by fura-2; the nuclear translocation of GFP-NFAT fusion protein was observed by VEGF stimulation under the fluorescence microscope; real-timePCR was used to detect the expression of bone morphogenetic genes of BMP-2, Cbfa1, osteocalcin and osteoprotegerin, and Von Kossa staining was used to detect the cells. Calcification.
Results: the stimulation of 100ng/ml VEGF stimulated the production of calcium oscillation in the human pulmonary artery valve endothelial cells, the frequency was 0.3 + 0.03 times /min, the width of the wave was 80 + 3.5S, and the NFAT rapid nuclear transposition.BMP-2, the mRNA levels of Cbfa1, osteocalcin and osteoprotegerin all increased in 6-24 hours after the stimulation, and fell about 48 hours. 72 hours after stimulation. Calcified plaques were found in the matrix of cultured monolayer cells.
Conclusion: VEGF induces the expression of ossification related genes in the valvular endothelial cells and promotes the calcification of endothelial cells, which is related to the activation of NFAT activation and nuclear transposition by VEGF stimulation of the calcium oscillation in the valve endothelial cells.
(the second part)
Background: Fluvastatin is a statin drug, an inhibitor of the HMG-CoA reductase, which can block the metholvalic acid metabolic pathway by combining with the active center of HMG-CoA reductase and play a protective role in cardiovascular protection.
Objective: To investigate whether fluvastatin can inhibit the calcification of valvular endothelial cells caused by VEGF and its relationship with intracellular calcium signaling.
Methods: the cultured human pulmonary artery endothelial cells were pretreated with fluvastatin for 24 hours, then were stimulated by 100ng/ml VEGF, fura-2 was used to detect intracellular calcium signal, the plasmid expressing GFP-NFAT fusion protein was transfected into cells, and the nuclear transposition of GFP-NFAT after VEGF stimulation was observed under the fluorescence microscope; real-time PCR detected BMP-2, Cbfa1, osteocalcin and others. Otegerin and other bone formation related genes were expressed and Von Kossa staining was used to detect cell calcification.
Results: the pretreatment of 10nM fluvastatin inhibited the production of calcium oscillation in the valve endothelial cells and the subsequent NFAT nuclear transposition.BMP-2, and the mRNA level of the bone formation related genes, such as Cbfa1, osteocalcin and osteoprotegerin, decreased (50.61 + 10.88)%, (82.23 + 22.11)%, (85.58 + 19.03)% and (85.57 + 8.42)%.VEGF stimulation for 72 hours. No calcified plaque was found in the matrix of monolayer cells.
Conclusion: fluvastatin effectively inhibits the calcification of valvular endothelial cells caused by VEGF, and this effect is achieved through the NFAT signaling pathway that inhibits the intracellular calcium signal dependence.
(the third part)
Background: GGPP is another class of isoprene that is blocked by statins except cholesterol. The study suggests that various protective pharmacological actions of statins are related to the synthesis of GGPP, which may affect the activity of small and medium G proteins in cells.
Objective: To investigate the mechanism of fluvastatin inhibiting VEGF Induced Calcification of valve endothelial cells.
Methods: the cultured human pulmonary artery endothelial cells were pretreated with GGPP and fluvastatin for 24 hours, then were stimulated by 100ng/ml VEGF, fura-2 was used to detect intracellular calcium signal, the plasmid expressing NFAT-GFP fusion protein was transfected into cells, and the nuclear transfer of NFAT was observed by VEGF stimulation under fluorescence microscope; real-time PCR detection BMP-2, cbfal, etc. Steoprotegerin and other bone formation related genes were expressed and Von Kossa staining was used to detect cell calcification.
Results: after the co pretreatment of 10nM GGPP and fluvastatin, VEGF can still induce the production of calcium oscillation in the valve endothelial cells, the frequency is 0.074 + 0.02 times / min, the width of the wave is 65.7 + 8.8S, and the nuclear transposition of NFAT.BMP-2, cbfal, osteocalcin and osteoprotegerin mRNA levels are increased by 1.88 +. 3.7 and 2.34 + 0.16 times.VEGF, 72 hours after stimulation, calcified plaques were found in cultured monolayer cells.
Conclusion: GGPP reverses the inhibitory effect of fluvastatin on the calcification of vascular endothelial cells induced by VEGF, indicating that the protective effect of fluvastatin on vascular calcification is achieved by blocking the GGPP.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2100433