本文選題：siRNA + 表達載體��； 參考：《南昌大學》2011年碩士論文

【摘要】：抑制巨噬細胞(MΦ)的吞噬體與溶酶體融合是結(jié)核分枝桿菌(Mtb)逃避免疫系統(tǒng)殺傷和在機體內(nèi)長期潛伏的主要機制。近年的研究發(fā)現(xiàn),Mtb感染后可誘導MΦ內(nèi)的一種富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白(Tryptophan-aspartate containing coat protein, TACO)迅速分布并局限于含活Mtb的吞噬體的膜上,阻斷Mtb吞噬體與溶酶體的融合。進一步的研究發(fā)現(xiàn),TACO是被吞噬的Mtb在MΦ內(nèi)生存必不可少的條件,阻斷TACO的表達可有效促進Mφ吞噬體與溶酶體的融合,從而提高巨噬細胞殺傷和清除Mtb的能力。因此,通過某種有效而特異的手段抑制MΦ內(nèi)TACO的表達可能是一種清除體內(nèi)Mtb最為直接和有效的辦法。本研究構(gòu)建了MΦTACO基因特異性小干擾RNA (siRNA)的真核表達質(zhì)粒,通過特異性RNAi (RNA interference, RNAi)抑制MΦ內(nèi)TACO的表達,并且利用經(jīng)過基因改造的恥垢分枝桿菌Msl-2c作為載體,使其在MΦ內(nèi)定位表達TACO mRNA特異性的siRNA,通過RNA干擾技術(shù)高效特異地抑制TACO表達,從而清除體內(nèi)的Mtb,為進一步利用siRNA研究基因的功能及治療結(jié)核病奠定了基礎(chǔ)。 第一部分TACO特異性siRNA真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 目的：構(gòu)建針對TACO基因的特異性siRNA的真核表達質(zhì)粒,為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：參照invitrogen公司在線設(shè)計siRNA軟件設(shè)計三對互補的單鏈DNA,包括siRNA的正義鏈和反義鏈,并且設(shè)計了一組對照序列。在互補單鏈中間連有l(wèi)oop環(huán),loop環(huán)兩側(cè)為21bp的以正反向組合的干擾序列,兩端為BamHⅠ和BbsⅠ酶切位點的粘性末端。針對這些篩選的siRNA序列,合成該序列的OligoDNA,經(jīng)退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)BamHⅠ和BbsⅠ雙酶切后的pGPU6/ GFP/Neo載體連接,構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-taco(簡稱pST)干擾質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,挑取重組陽性克隆進行酶切鑒定和測序鑒定。 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序結(jié)果證實,siRNA核苷酸序列正確插入到表達載體pGPU6/GFP/Neo中,成功構(gòu)建了TACO基因特異性的siRNA表達質(zhì)粒pST1、pST2、pST3及對照siRNA表達質(zhì)粒pST4。 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對TACO基因干擾序列的表達載體pST。 第二部分siRNA真核表達質(zhì)粒在細胞內(nèi)的表達及其抑制TACO表達效果的檢測 目的：將干擾質(zhì)粒pST1、pST2、pST3和對照質(zhì)粒pST4轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7和293T細胞,在細胞水平檢測TACO的表達變化。 方法：采用RT-PCR方法自小鼠巨噬細胞系RAW264.7中擴增獲取taco基因片段,并將之克隆入真核表達質(zhì)粒pQE30中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-taco。以pQE30-taco作為標準物建立熒光定量PCR法檢測taco基因水平的標準曲線。在此基礎(chǔ)上,本部分研究采用了三種不同的方法對taco特異性siRNA表達質(zhì)粒對巨噬細胞TACO表達的影響進行了研究：(1)采用pST1、pST2、pST3、pST4轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7,分別采用熒光定量RT-PCR和免疫印跡法在mRNA和蛋白水平檢測巨噬細胞的TACO表達變化。但由于RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染效率低下,pST1、pST2、pST3、pST4轉(zhuǎn)染后熒光定量RT-PCR和免疫印跡法均未檢測到TACO的表達有明顯的改變。(2)采用pST1、pST2、pST3、pST4轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7,然后以TACO特異性抗體為一抗,紅色熒光蛋白標記的二抗對細胞進行免疫熒光染色,在單細胞水平比較獲pST質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(表達綠色熒光蛋白)和未獲轉(zhuǎn)染的細胞的紅色熒光的熒光強度,評價siRNA表達質(zhì)粒對TACO表達的影響。(3)利用293T細胞轉(zhuǎn)染效率高,本身不表達TACO的特點,構(gòu)建TACO與紅色熒光蛋白(RFP)表達基因的融合基因表達質(zhì)粒：pCDNA3.1-Red-taco(簡稱p3.1-RT),用p3.1-RT和TACO特異性siRNA表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,再采用免疫印跡方法檢測TACO的表達改變。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞后熒光定量PCR和western blot圖片表明沒有明顯的差異。在pST干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞后用’TACO蛋白做細胞免疫熒光表明細胞內(nèi)TACO表達明顯的降低。在293T細胞中,在蛋白質(zhì)水平檢測到了TACO的變化。 結(jié)論：pST干擾質(zhì)�？墒箃aco mRNA及蛋白水平表達下降。 第三部分重組恥垢分枝桿菌菌苗rMs-pSTM的構(gòu)建及鑒定 目的：利用經(jīng)過基因改造的恥垢分枝桿菌Msl-2c作為載體,靶向遞送小干擾RNA的真核表達質(zhì)粒,觀察其靶向性。 方法：將分枝桿菌的復制子ORIM用分子克隆的方法連入siRNA表達質(zhì)粒pST1-4中,得到pSTM1-4,然后電穿孔入Msl-2c中,構(gòu)建可靶向遞送pSTM1-4質(zhì)粒進入MΦ中進行表達的重組恥垢分枝桿菌rMs-pSTM1-4并用PCR的方法鑒定,大量擴增重組恥垢分枝桿菌菌苗rMs-pSTM,并分別用其感染RAW264.7細胞。 結(jié)果：分枝桿菌的復制子ORIM連入siRNA表達質(zhì)粒pST中,電穿孔入Msl-2c成功,篩選并大量擴增了恥垢分枝桿菌菌苗rMs-pSTM。感染RAW264.7后,抗酸染色后在細胞中能看到其靶向性。 結(jié)論：rMs-pSTM感染RAW264.7后,能觀察到其靶向性。
[Abstract]:In recent years , it has been found that TACO is an essential condition for the survival of Mtb .

Construction of eukaryotic expression plasmid of the first partial TACO - specific siRNA

Objective : To construct eukaryotic expression plasmid for specific siRNA targeting TACO gene and lay a foundation for subsequent research .

Methods : Three pairs of complementary single - stranded DNA , including the sense strand and antisense strand of siRNA , were designed by reference invitrogen ' s online design siRNA , and a set of control sequences were designed .

Results : After restriction endonuclease digestion and DNA sequencing , siRNA nucleotide sequences were correctly inserted into the expression vector pGPU6 / GFP / Neo . siRNA expression plasmids pST1 , pST2 , pst3 and control siRNA expression plasmid pST4 were successfully constructed .

Conclusion : The expression vector pST for TACO gene interference sequence has been successfully constructed .

The expression of eukaryotic expression plasmid in the second part of siRNA and its inhibition on the expression of TACO

Objective : To investigate the expression and change of TACO at the level of cell level by transfection of the interfering plasmids pST1 , pST2 , pst3 and control plasmid pST4 into the mouse macrophage system RAW264.7 .

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本文編號：2083192