本文選題：結(jié)核分枝桿菌 + 特異性抗原��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是嚴(yán)重威脅全世界的主要致死疾病之一。盡管人們在出生不久便注射了卡介苗(BCG),但由于BCG存在著免疫缺失,免疫保護力低等缺陷,導(dǎo)致每年因患結(jié)核病而死亡的人數(shù)在不斷地增加,且已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會問題,因此新型結(jié)核疫苗的研制一直是眾多研究學(xué)者的研究重點,而疫苗研究的關(guān)鍵則在于抗原的選擇,目前處于研發(fā)階段的結(jié)核抗原主要有ESAT-6、CFP10、Ag85A等。近年來,隨著納米技術(shù)在生物、醫(yī)藥等方面的研究,納米佐劑、納米載藥系統(tǒng)研究的不斷成熟又為結(jié)核疫苗研究者們帶來新的突破,這主要緣于納米粒子(nanoparticles,NP)具有粒徑小、粒徑一般在1-100nm之間,可經(jīng)過人體毛細(xì)血管分布至特定組織,因此能夠達(dá)到藥物緩釋或控釋的作用,可致力于單次免疫疫苗的開發(fā)。本研究擬通過擴增特異性抗原基因,構(gòu)建原核重組質(zhì)粒與真核重組質(zhì)粒,一部分將原核重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白對小鼠進行皮下注射免疫,另一部分用無機納米(SiNP)包裹真核重組質(zhì)粒對小鼠進行肌肉注射,同時進行納米質(zhì)粒與細(xì)胞共培養(yǎng),觀察核酸DNA在細(xì)胞和肌肉組織中的表達(dá)變化,為結(jié)核病在納米緩釋疫苗中的研究提供了一定的實驗依據(jù)。 方法：通過PCR擴增ESAT-6、CFP10、MPT51、PpiA蛋白編碼的基因,選擇CFP10基因構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pET-30a-CFP-10及表達(dá)純化蛋白,用純化后的蛋白(40μg/只)免疫小鼠(0、21d),同時構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CFP10,制備納米核酸疫苗,一部分與細(xì)胞共培養(yǎng)48小時,一部分肌肉注射BALB/c小鼠(50μg/只),于3d后,取肌肉組織,進行冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察蛋白在細(xì)胞和肌肉組織中的變化。 結(jié)果：成功獲得原核重組質(zhì)粒pET-30a-CFP-10及純化的目的蛋白,并成功將65nm的SiNP與重組真核質(zhì)粒pEGFP-N1-CFP-10結(jié)合,注射小鼠肌肉后,觀察到注射肌肉組織中有紅色熒光出現(xiàn)(SiNP包裹紅色量子點所呈現(xiàn)的紅色熒光),證明成功將納米DNA注入肌肉組織中,‘觀察發(fā)現(xiàn)紅色納米熒光量子點,卻未見質(zhì)粒表達(dá)綠色熒光蛋白。納米DNA成功導(dǎo)入PK細(xì)胞中,并表達(dá)綠色熒光蛋白。 結(jié)論：成功克隆四種特異性抗原基因,表達(dá)了CFP10蛋白,構(gòu)建納米核酸疫苗SiNP-pEGFP-N1-CFP10并成功在小鼠肌肉中觀察,構(gòu)建CMS-pEGFP-N1成功導(dǎo)入PK細(xì)胞并成功表達(dá)綠色熒光蛋白。
[Abstract]:Objective: tuberculosis (TB) is one of the major fatal diseases in the world. Although people are injected with BCG shortly after birth, the number of deaths from TB is increasing every year because of deficiencies in BCG, such as lack of immunity and low immune protection. And has become a global public health and social concerns, so the development of new TB vaccine has been the focus of many researchers, and vaccine research is the key to the selection of antigens. At present, the major TB antigens in R & D are ESAT-6 CFP 10, Ag85 A and so on. In recent years, with the research of nanotechnology in biology, medicine and so on, the development of nano-adjuvant and nano-drug carrier system has brought new breakthrough for TB vaccine researchers, which is mainly due to the small particle size of nano-particles (nanoparticlesNP). The particle size is generally between 1-100nm and can be distributed to specific tissues through human capillaries, so it can achieve the function of drug release or controlled release, and can be devoted to the development of single immunization vaccine. The purpose of this study was to construct prokaryotic recombinant plasmid and eukaryotic recombinant plasmid by amplifying specific antigen gene. Some of the proteins expressed by prokaryotic recombinant plasmid were injected subcutaneously into mice. In the other part, mice were injected intramuscularly with inorganic nano-sized (SiNP) encapsulated eukaryotic recombinant plasmids, and then co-cultured with cells to observe the expression of nucleic acid DNA in cells and muscle tissues. It provides a certain experimental basis for the study of TB in nano sustained release vaccine. Methods: the gene encoding ESAT-6 CFP10 MPT51PpiA protein was amplified by PCR. The prokaryotic recombinant plasmid pET-30a-CFP-10 was constructed with CFP10 gene and the purified protein was expressed. Mice were immunized with the purified protein (40 渭 g / mouse) for 0 ~ 21 days, and the eukaryotic recombinant plasmid pEGFP-N1-CFP10 was constructed to prepare nano-nucleic acid vaccine. Some of them were co-cultured with cells for 48 hours, and others were injected intramuscularly into BALB / c mice (50 渭 g / mouse). After 3 days, the muscle tissues were taken and frozen sections were made. The changes of protein in cells and muscle tissues were observed under fluorescence microscope. Results: the prokaryotic recombinant plasmid pET-30a-CFP-10 and the purified target protein were successfully obtained, and the sip of 65nm was successfully combined with the recombinant eukaryotic plasmid pEGFP-N1-CFP-10. Red fluorescence was observed in the injected muscle tissue (red fluorescence presented by SiNP wrapped in red quantum dots), which proved the successful injection of nano-DNA into muscle tissue. However, the plasmid did not express green fluorescent protein. Nano-DNA was successfully introduced into competitive cells and expressed green fluorescent protein. Conclusion: four specific antigen genes were cloned successfully, and CFP10 protein was expressed. SiNP-pEGFP-N1-CFP10 was constructed and observed in mouse muscle successfully. CMS-pEGFP-N1 was successfully introduced into competitive cells and expressed green fluorescent protein.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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本文編號：2082532