本文選題：脫落乳牙干細胞 + 骨向分化　； 參考：《天津醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：目的： 體外分離、培養(yǎng)人脫落乳牙干細胞(SHEDs),分析其生物學特征,探討SHEDs骨向分化潛能,分不同時間點觀察成骨相關轉錄因子Runx2的動態(tài)表達規(guī)律,為研究SHEDs成骨調控因素及其組織再生臨床應用提供研究基礎。 方法： 依據(jù)Miura等的實驗方法,選取6～10歲健康兒童因滯留拔除的乳牙,采用酶消化法分離、有限稀釋法純化,獲得人脫落乳牙干細胞。觀察原代和傳代細胞生長、增殖情況,測定細胞克隆形成率,HE染色,觀察原代及傳代細胞形態(tài)學特征。流式細胞儀及細胞免疫熒光染色檢測SHEDs表面標志。培養(yǎng)的第3代SHEDs,在體外經含有IBMX、胰島素、消炎痛和氫化可的松條件培養(yǎng)液,向脂肪組織進行誘導分化,觀察細胞形態(tài)變化及細胞內形成脂滴情況,4周后油紅-O染色。第3代SHEDs,在含有10%胎牛血清、1×10-8mol/1地塞米松、50 mg/lβ-甘油磷酸鈉和10mmol/1維生素C的成骨誘導條件培養(yǎng)液誘導3周,觀察細胞形態(tài)和生長規(guī)律的變化,分別于成骨誘導第0天和第21天做茜素紅染色,檢測礦化結節(jié)形成情況,鑒定其成骨分化的生物學特征。于成骨誘導的第0、3、6、9、12、15、18和21天,用RT-PCR技術檢測Runx2的動態(tài)表達。 結果： 1.通過酶消化法和有限稀釋法獲得了人脫落乳牙干細胞,原代培養(yǎng)的細胞一般在接種2天后,倒置顯微鏡下見細胞貼壁生長,形態(tài)呈現(xiàn)多形性。隨著生長傳代,細胞較多的出現(xiàn)多角形、梭形,成纖維細胞樣,并且大小趨近一致。原代細胞爬片HE染色,大部分細胞呈梭形,體積較小,輪廓清晰,細胞核為圓形或卵圓形,體積較大。少數(shù)細胞內可見多個核仁存在。 2.計算細胞克隆形成率為22-26個/103細胞。流式細胞儀和細胞免疫熒光染色檢測細胞表面標志顯示,CD146+占總細胞量的92.51±1.34%,STRO-1+占總細胞量的20.01±1.62%。在成脂誘導體系的的作用下,可見個別細胞胞漿內出現(xiàn)高強度的折射點,油紅－O染色可見橙紅色陽性顆粒。在礦化誘導液的作用下,細胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切?形成鈣化結節(jié),經茜素紅色呈陽性。 3.RT-PCR技術檢測SHEDs成骨誘導過程中Runx2的動態(tài)表達規(guī)律顯示：0天已有表達,0～6天成明顯增強趨勢,6～12天顯著下降,12～18天表達再次上升,以后相對平穩(wěn)。 結論： 1.SHEDs可體外分離、培養(yǎng),表達間充質干細胞表面標志,具有較強的倍增能力及克隆形成能力,具有成脂和成骨向分化能力。 2.Runx2在SHEDs成骨分化過程中成動態(tài)表達,成骨分化各階段均有表達,早期和晚期表達上升,中期表達有下降趨勢。
[Abstract]:Objective: to isolate and culture human deciduous dental stem cells (Sheds) in vitro, analyze their biological characteristics, explore the potential of bone differentiation and observe the dynamic expression of osteoblastic transcription factor Runx2 at different time points. To provide a basis for the study of osteogenesis regulation factors and clinical application of tissue regeneration in Sheds. Methods: according to Miura et al.'s experimental method, the deciduous teeth of 6 ~ 10 years old healthy children were isolated by enzyme digestion and purified by limited dilution method, and human deciduous tooth stem cells were obtained. The growth and proliferation of primary and passage cells were observed, the cell clone formation rate was determined by HE staining, and the morphological characteristics of primary and passage cells were observed. The surface markers of Sheds were detected by flow cytometry and immunofluorescence staining. The third generation of SHEDs was induced to differentiate into adipose tissue in vitro with IBM X, insulin, indomethacin and hydrocortisone conditioned medium. The morphological changes of cells and lipid droplets in the cells were observed after 4 weeks of oil red-O staining. The third generation of Sheds was induced in osteogenic conditioned medium containing 10% fetal bovine serum of 1 脳 10-8mol/1 dexamethasone 50 mg/l 尾 -glycerophosphate and 10mmol/1 vitamin C for 3 weeks. The changes of cell morphology and growth pattern were observed. Alizarin red staining was performed on day 0 and day 21 of osteogenesis to detect the formation of mineralized nodules and to identify the biological characteristics of osteogenic differentiation. The dynamic expression of Runx2 was detected by RT-PCR on the 18th and 21st days after osteogenesis induction. Results: 1. Human deciduous tooth stem cells were obtained by enzyme digestion and finite dilution method. The cells cultured in primary culture generally showed adherent growth under inverted microscope 2 days after inoculation. The morphology of the cells showed pleomorphism. With the growth and passage, the cells appeared polygonal, fusiform, fibroblast-like, and the size of the cells tended to be the same. He staining showed that most of the cells were fusiform, small in volume, clear in outline, round or oval in nucleus and larger in volume. Several nucleoli can be seen in a few cells. 2. The cell clone formation rate was calculated to be 22-26 / 103 cells. Flow cytometry and immunofluorescence staining showed that CD146 accounted for 92.51 鹵1.34% of the total cell count. STRO-1 accounted for 20.01 鹵1.62% of the total cell count. High intensity refraction points were observed in the cytoplasm of individual cells under the action of lipid induction system, and orange red positive granules were observed by oil red-O staining. Under the action of the mineralizing inducer, the cells become polygonal and form calcified nodules. The dynamic expression of Runx2 was detected by RT-PCR during osteogenic induction of Sheds. The results showed that the expression of Runx2 was significantly increased at 0 day and increased at 6 days. The expression of Runx2 increased again on day 1218 after 612 days, and the expression of Runx2 increased again at 1218 days after ossification induced by SHEDs. The future is relatively stable. Conclusion: 1. Sheds can be isolated, cultured and expressed the surface markers of mesenchymal stem cells in vitro. 2. Runx2 was expressed dynamically in the process of osteogenic differentiation of Sheds. The expression of Runx2 was found in all stages of osteogenic differentiation. The expression of Runx2 increased in early and late stages, and decreased in middle stage.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：2078721