發(fā)布時(shí)間：2018-06-26 10:36

  本文選題：椎間盤細(xì)胞 + 壓力　； 參考：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：第一部分兔椎間盤細(xì)胞氣壓加壓培養(yǎng)模型的建立 目的建立兔椎間盤細(xì)胞體外氣壓加壓培養(yǎng)模型,觀察在持續(xù)靜壓力培養(yǎng)12h、24h和36h后兔椎間盤細(xì)胞生物學(xué)行為改變,評(píng)價(jià)該細(xì)胞加壓模型的優(yōu)缺點(diǎn)。 方法將體外培養(yǎng)的兔纖維環(huán)和髓核細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(不加壓)、加壓12h組、24h組和36h組,在1MPa壓力下干預(yù)后觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、增殖活性和細(xì)胞基質(zhì)(COAⅠ、Ⅱ及AGG)表達(dá)改變。 結(jié)果加壓培養(yǎng)后,倒置相差顯微鏡下纖維環(huán)和髓核細(xì)胞均有不同程度密度減低和細(xì)胞體積減小,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形變。加壓24h和36h可見(jiàn)明顯纖維環(huán)和髓核細(xì)胞增殖活性抑制；髓核細(xì)胞加壓時(shí)間12h后即出現(xiàn)AGG的mRNA表達(dá)下降,而加壓時(shí)間24h后出現(xiàn)COAⅡ的mRNA表達(dá)下降；纖維環(huán)細(xì)胞加壓時(shí)間24h后COAⅠ、Ⅱ的mRNA均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)下降。 結(jié)論該細(xì)胞氣壓加壓培養(yǎng)裝置可短期內(nèi)模擬機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致的兔椎間盤細(xì)胞退變改變,為實(shí)驗(yàn)室實(shí)施體外壓力細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供了一種簡(jiǎn)單、安全的方案。 第二部分線粒體凋亡途徑參與過(guò)度壓力誘導(dǎo)的兔椎間盤細(xì)胞的凋亡 目的探討過(guò)度機(jī)械壓力刺激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的兔纖維環(huán)和髓核細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)途徑。 方法將體外培養(yǎng)的兔椎間盤纖維環(huán)和髓核細(xì)胞給予1MPa的持續(xù)機(jī)械壓力干預(yù)12h、24h和36h,另設(shè)不加壓的對(duì)照組,各4組。各組纖維環(huán)和髓核細(xì)胞達(dá)到加壓時(shí)間后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位平均相對(duì)熒光強(qiáng)度,酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase-8,9,3活性。 結(jié)果流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示纖維環(huán)細(xì)胞加壓24h組、36h組和髓核細(xì)胞加壓12h組、24h組和36h組均出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡增加；熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,加壓24h組和36h組的纖維環(huán)和髓核細(xì)胞以綠色熒光為主,紅色熒光明顯減少,細(xì)胞線粒體膜電位均明顯下降；酶標(biāo)儀結(jié)果顯示髓核細(xì)胞組加壓后caspase-8,9,3活性均升高,而纖維環(huán)細(xì)胞組加壓后caspase-9活性明顯增強(qiáng),caspase-8活性無(wú)明顯變。 結(jié)論1MPa靜壓力加壓時(shí)間24h作為過(guò)度機(jī)械壓力可以明顯誘導(dǎo)椎間盤纖維環(huán)和髓核細(xì)胞的凋亡。機(jī)械壓力誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑主要是由線粒體依賴的凋亡途徑參與的,而線粒體依賴途徑和DISC途徑(非線粒體依賴途徑)二者則均參與了髓核細(xì)胞的凋亡。 第三部分過(guò)度壓力對(duì)兔內(nèi)外層纖維環(huán)細(xì)胞線粒體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響 目的研究過(guò)度機(jī)械壓力對(duì)體外藻酸鹽串珠培養(yǎng)的兔椎間盤內(nèi)外層纖維環(huán)細(xì)胞線粒體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響。 方法將體外藻酸鹽串珠培養(yǎng)的兔纖維環(huán)細(xì)胞分為四組：OA1組為外層纖維環(huán)細(xì)胞,不加壓；OA2組為外層纖維環(huán)細(xì)胞,1MPa壓力干預(yù)24h；IA1組為內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞,不加壓；IA2組,內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞,1MPa壓力干預(yù)24h。加壓完成后,熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ATP產(chǎn)量,熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體膜電位和活性氧簇的釋放,分光光度計(jì)檢測(cè)4種線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性和透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果兔纖維環(huán)細(xì)胞經(jīng)1MPa壓力作用24h后,與各對(duì)照組相比,內(nèi)外層纖維環(huán)細(xì)胞均可見(jiàn)ATP產(chǎn)量明顯減少,活性氧簇釋放增加,線粒體膜電位顯著下降,細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)損傷的病理改變；外層纖維環(huán)細(xì)胞呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ活性相比對(duì)照組顯著下降,而內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞呼吸鏈酶復(fù)合物僅Ⅲ和Ⅳ活性相比對(duì)照組明顯下降。外層纖維環(huán)細(xì)胞的線粒體損傷作用更為明顯。 結(jié)論過(guò)度壓力負(fù)荷損害椎間盤細(xì)胞線粒體的能量代謝功能,并使線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯病理改變,這可能是從能量代謝角度研究椎間盤退變的重要機(jī)制。
[Abstract]:Part one establishment of rabbit air pressure culture model for intervertebral disc cells
Objective to establish an in vitro pressure culture model of rabbit disc cells in vitro, and to observe the biological behavior changes of the intervertebral disc cells after continuous static pressure culture of 12h, 24h and 36h, and evaluate the advantages and disadvantages of the pressure model of the cells.
Methods rabbit fibrorings and nucleus pulposus cells were randomly divided into control group (non pressurized), pressure 12h group, 24h group and 36h group. The changes of cell morphology, proliferation activity and expression of cell matrix (COA I, II and AGG) were observed under the pressure of 1MPa.
Results after pressure culture, the density of the rings and nucleus pulposus cells in the inverted phase contrast microscope were reduced to varying degrees and the cell volume decreased, and the cells showed long spindle deformation. The proliferation activity of the fibrous ring and nucleus pulposus cells was obviously inhibited by the pressure 24h and 36h, and the mRNA expression of AGG decreased after the compression time of the nucleus pulposus cells, and the pressure time was 24h after 12h. The expression of mRNA in COA II decreased, and the expression of mRNA in COA I and II decreased in different degrees after 24h compression.
Conclusion the cell pressure pressure culture device can simulate the degeneration and change of the intervertebral disc cells in rabbits in the short term. It provides a simple and safe way for the laboratory to carry out the in vitro pressure cell experiment.
The second part of mitochondrial apoptotic pathway is involved in the apoptosis of rabbit intervertebral disc cells induced by overpressure.
Objective to investigate the main pathway of apoptosis induced by overmechanical pressure stimulation in rabbit fibroblast and nucleus pulposus cells in vitro.
Methods the intervertebral disc and nucleus pulposus cells cultured in vitro were given the continuous mechanical pressure of 1MPa, 12h, 24h and 36h, and the non pressurized control group was set up in 4 groups. The cell apoptosis was detected by flow cytometry, fluorescence microscopy, fluorescence spectrophotometer and laser confocal microscope after the compression time was reached. The mean relative fluorescence intensity of mitochondrial membrane potential was detected, and caspase-8,9,3 activity was detected by enzyme labelling apparatus.
Results the results of flow cytometry showed that the 24h group was pressurized in the fibrous ring cells, the 36h group and the nucleus pulposus cells were pressurized in the 12h group, and the apoptosis increased in both 24h and 36h groups. Fluorescence microscopy, fluorescence spectrophotometer and laser confocal microscopy showed that the fibrous ring and nucleus pulposus cells of group 24h and 36h group were mainly green fluorescence, red The cell mitochondrial membrane potential of the cells decreased obviously, and the results of the enzyme labeling showed that the activity of caspase-8,9,3 in the nucleus pulposus group increased and the activity of caspase-9 increased obviously after the compression of the fibrous ring cell group, and the activity of caspase-8 was not significantly changed.
Conclusion the apoptosis of the intervertebral disc and nucleus pulposus cells can be induced by the excessive mechanical pressure of 1MPa 24h. The apoptotic signaling pathway induced by mechanical pressure is mainly involved in the mitochondrial dependent apoptosis pathway, while the mitochondrial dependent pathway and the DISC pathway (non mitochondrial dependent pathway) are the two ones. All of them were involved in the apoptosis of nucleus pulposus cells.
The third part is the effect of excessive pressure on mitochondrial function and ultrastructure of rabbit's inner and outer fibrosus cells.
Objective to study the effects of excessive mechanical pressure on mitochondrial function and ultrastructure of rabbit intervertebral disc in vitro.
Methods rabbit fibroring cells cultured in vitro alginate beads were divided into four groups: OA1 group was outer layer of fibrous ring cells, non pressurization, OA2 group was outer layer of fibrous ring cells, 1MPa pressure intervened 24h, IA1 group was inner layer of fibrous ring cells, non pressurization, IA2 group, inner fibrous ring cells, 1MPa pressure intervention 24h. pressure completion, fluorescent enzyme labeling instrument detected AT The P yield, the fluorescence microscope and the fluorescence spectrophotometer were used to detect the mitochondrial membrane potential and the release of the active oxygen cluster. The spectrophotometer was used to detect the activity of 4 mitochondrial respiratory chain enzyme complexes and the ultrastructure of the mitochondria.
Results after the 1MPa pressure action of 24h, the output of ATP in the inner and outer fibroring cells was significantly reduced, the release of active oxygen cluster increased, the mitochondrial membrane potential decreased significantly, the mitochondrial ultrastructure showed a pathological change in the ultrastructure of the mitochondria, and the respiratory chain enzyme complex in the outer layer of fibrous ring cells I, III and IV live. Compared with the control group, the respiratory chain enzyme complex in the inner layer was significantly lower than that in the control group. The damage of the mitochondria in the outer fibrous ring cells was more obvious.
Conclusion overstress damage can damage the energy metabolism of the mitochondria of the intervertebral disc cells and make the morphologic structure of the mitochondria pathological changes. This may be an important mechanism for the study of the degeneration of intervertebral disc from the angle of energy metabolism.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2070103