發(fā)布時間：2018-06-23 19:09

  本文選題：A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素 + 雙價單鏈抗體　； 參考：《中國生物工程雜志》2017年04期

【摘要】：目的:為防治A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素引起的腸毒血癥及氣性壞疽等相關(guān)疾病,構(gòu)建并高效表達(dá)中和α毒素(CPA)的特異性雙價單鏈抗體,并對其生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。方法:以全人源噬菌體抗體庫中篩選得到的抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單鏈抗體sc Fv基因?yàn)槟０?PCR的方法擴(kuò)增兩條單鏈抗體片段并通過引物設(shè)計引入中間連接肽G4S或(G4S)3,亞克隆至原核表達(dá)載體p ET-28a(+),轉(zhuǎn)化E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的層析純化;Western blot和間接ELISA方法檢測與抗原的免疫結(jié)合活性;通過體外檢測抗體抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及體內(nèi)小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)初步研究雙價單鏈抗體的生物學(xué)活性。結(jié)果:雙酶切鑒定及基因測序結(jié)果表明構(gòu)建的雙價單鏈抗體sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正確,誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)12%SDS-PAGE分析,兩者均以包涵體形式表達(dá)且蛋白分子量符合理論值大小,Western blot和間接ELISA分析結(jié)果顯示,構(gòu)建的雙價單鏈抗體與抗原CPA具有特異結(jié)合活性,且sc(Fv)2-15與抗原的結(jié)合活性明顯高于sc(Fv)2-5和sc Fv,體外與體內(nèi)生物活性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力較sc(Fv)2-5和sc Fv具有明顯優(yōu)勢。結(jié)論:成功制備了抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的全人源雙價單鏈抗體,為進(jìn)一步研究該毒素引發(fā)的各類疾病的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: in order to prevent and treat enterotoxemia and gas gangrene caused by Clostridium perfringens 偽 toxin type A, the bivalent single-chain antibody of neutralizing 偽 toxin (CPA) was constructed and expressed, and its biological activity was studied. Methods: two single-chain antibody fragments were amplified by PCR from the full-human phage antibody library against Clostridium perfringens 偽 -toxin single chain antibody sc Fv, and the intermediate ligand peptide was introduced by primer design. G4S or (G4S) 3 was subcloned into prokaryotic expression vector pET-28a (), and transformed into E. coli 21 and induced by IPTG. Western blot and indirect Elisa were used to detect the immunobinding activity of the expressed product. The biological activity of bivalent single chain antibody (bivalent single chain antibody) was preliminarily studied by in vitro detection of antibody inhibiting the activity of CPA hydrolyzed lecithin and lysotic activity as well as the protection test of mice against virus attack in vivo. Results: the bivalent single-chain antibodies sc (FV) 2-5 and sc (FV) 2-15 were confirmed by double enzyme digestion and gene sequencing. The expression of sc (FV) 2-5 and sc (FV) 2-15 were analyzed by 12SDS-PAGE. The results of Western blot and indirect Elisa analysis showed that the constructed bivalent single-chain antibody had specific binding activity to antigen CPA. The binding activity of sc (FV) 2-15 to antigen was significantly higher than that of sc (FV) 2-5 and sc Fv. The results of bioactivity tests in vitro and in vivo further proved that the ability of Sc (FV) 2-15 neutralizing toxin was superior to that of SC (FV) 2-5 and sc Fv. Conclusion: the full-human bivalent single-chain antibody against Clostridium perfringens 偽 toxin A was successfully prepared, which laid a foundation for the further study of the diagnosis and treatment of various diseases caused by the toxin.
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所;
【分類號】：R392

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本文編號：2058108