本文選題：通絡干預 + 缺氧耐受性��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2011年博士論文

【摘要】：目的:自適應是生物體作為復雜系統(tǒng)在長期進化過程中適應環(huán)境賴以生存延續(xù)的基本能力。低氧或缺氧不僅是缺血性心、腦血管病等常見病的基本病理過程,同時隨著西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實施更多的內(nèi)陸平原地區(qū)人群進入高原地區(qū),高原低氧導致的急性高原反應(AMS)、高原肺水腫等疾病嚴重危害機體健康,機體缺氧自適應調(diào)節(jié)能力是提高缺氧耐受性的關鍵機制,因此提高機體缺氧自適應調(diào)節(jié)能力研究成為尋找抗缺氧有效干預策略和藥物的重大課題。本研究在中醫(yī)脈絡學說“承制調(diào)平”理論指導下,在既往絡病理論代表性藥物通心絡(以下簡稱TXL)治療缺血性心腦血管病取得確切療效基礎上,進一步探討對提高機體缺氧耐受性的影響及相關機制:觀察TXL對平原地區(qū)赴藏旅游人群缺氧耐受性的影響;建立急性缺氧兔模型,研究TXL對模型兔缺氧耐受性的影響及其作用機制;建立急性缺氧預適應小鼠模型,觀察TXL對進一步提高缺氧自適應調(diào)節(jié)能力的作用并探討其機制;研究PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在TXL提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)缺氧耐受性中的關鍵作用。 方法:本研究分為以下四部分內(nèi)容 1通絡干預提高平原地區(qū)赴藏旅游人群缺氧耐受性隨機、雙盲、安慰劑對照研究 以赴藏旅游人群為由平原進入高原地區(qū)缺氧人群的代表,采用隨機、雙盲、安慰劑對照研究,選擇納入復合標準的志愿者120人按1:1隨機被分到安慰劑組或TXL組,按隨機號進行分組及藥物發(fā)放,組織進行為期10天的赴藏旅游,旅游3天前開始服用藥物,按不同的觀測地點填寫AMS調(diào)查問卷,監(jiān)測脈搏血氧飽和度,進行動脈血氣分析。試驗完成后,將數(shù)據(jù)錄入到臨床試驗遠程數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)并校對,確定數(shù)據(jù)庫后,進行首次揭盲,統(tǒng)計分析得出結(jié)果,再進行第二次揭盲。 2通絡干預對急性缺氧兔缺氧耐受性的影響 將24只新西蘭大耳白家兔隨機分為對照組、缺氧組和TXL組,先在11.4%氧環(huán)境下低氧實驗,分別在缺氧前,缺氧5min,30min,60min時進行動脈血氣分析,60min后進行密閉缺氧,觀察兔密閉缺氧耐受時間,按時間點檢測兔動脈血氧分壓和血氧飽和度,ELISA法檢測血清缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)的含量、Western blot法檢測主動脈組織HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的蛋白表達。 3通絡干預對缺氧預適應小鼠缺氧耐受性的作用及機制研究 3.1雄性昆明小鼠隨機分為缺氧預適應組(對照組)與TXL組,TXL組按1.52g生藥/Kg/d,灌胃給藥,兩組動物分別進行0次(H0)、1次(H1)、3次(H3)、5次(H5)重復缺氧暴露,小鼠置于低氧密閉瓶中,通過小鼠呼吸消耗瓶內(nèi)氧造成瓶內(nèi)低氧,以小鼠出現(xiàn)喘呼吸為低氧耐受極限,然后將小鼠轉(zhuǎn)到另一低氧密閉瓶中,依此類推,連續(xù)進行5次低氧。記錄它們的缺氧耐受時間,利用Western blot方法檢測腦組織HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax蛋白的表達。 3.2 40只雄性昆明小鼠隨機分為正常對照組、低氧組、低氧預適應組和TXL組(低氧預適應+TXL),每組10只,利用重復低氧5次復制低氧預適應小鼠模型后,進行缺氧實驗,記錄小鼠每次低氧耐受的時間,觀察小鼠大腦皮層神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 4 PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在TXL提高HUVEC缺氧耐受性中的關鍵作用 4.1將體外培養(yǎng)的HUVEC分為常氧對照組、TXL組、缺氧組、缺氧+TXL(100μg/ml)組共4組。對照組和TXL組細胞置于常氧條件下:5%CO2+95%空氣;缺氧組、缺氧+通心絡組細胞置于低氧條件下: 1%O2+5%CO2+94%N2。分別在缺氧12h、24h、48h,利用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測細胞的增殖率,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。4.2將體外培養(yǎng)的HUVEC分為對照質(zhì)粒(GFP)組、DN-HIF組、△p85組、DN-Akt組,每組又分為對照組與TXL組,利用HIF-1α顯性負性突變體DN-HIF、PI3K顯性負性突變體p85、Akt顯性負性突變體DN-Akt瞬時轉(zhuǎn)染相應的HUVEC細胞后,將細胞置入1%O2+5% CO2+94%N2的低氧條件下,分別在缺氧12h、24h、48h,利用CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖率和存活率,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。在缺氧4h、12h、24h、36h,利用Western blot方法檢測HIF-1α蛋白表達變化及Akt磷酸化水平。 結(jié)果: 1通絡干預提高平原地區(qū)赴藏旅游人群缺氧耐受性隨機、雙盲、安慰劑對照研究 1.1 TXL對赴藏旅游人群AMS發(fā)生率的影響隨海拔高度的升高,兩組AMS發(fā)生率均逐漸增加,后隨缺氧時間的延長,兩組AMS逐漸降低,表明機體具有缺氧自適應調(diào)節(jié)能力。與對照組比較,TXL組旅游人群在昆侖山口(觀察4)、初到拉薩(觀察6)、日喀則(觀察10)三地AMS發(fā)生率均明顯降低(P0.05),其他觀察點TXL有降低趨勢,自西寧至拉薩赴藏旅途中總AMS發(fā)生率明顯低于對照組(P0.05),往返旅游全程中AMS總發(fā)生率亦明顯降低(P0.05),表明TXL提高了平原地區(qū)進入高原缺氧環(huán)境人群的缺氧耐受性。 1.2 TXL對赴藏旅游人群動脈血氧分壓及血氧飽和度的影響與始發(fā)地石家莊(觀察1)比較,兩組人群在拉薩(觀察6)動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯降低(P0.01),此后隨缺氧時間的延長,與觀察6比較,離開拉薩前一天(觀察14)兩組人群動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯升高(P0.01),顯示了機體具有缺氧自適應調(diào)節(jié)能力。在拉薩觀察6和觀察14,TXL組較對照組動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯升高(P0.01),表明TXL明顯提高了缺氧環(huán)境中的機體缺氧耐受能力。 1.3 TXL對赴藏旅游人群脈搏血氧飽和度的影響與低海拔地區(qū)比較,隨海拔高度的升高,兩組人群脈搏血氧飽和度明顯降低(P0.01);隨缺氧時間的延長,對照組與TXL組兩組人群脈搏血氧飽和度明顯升高(P0.01)。與對照組比較,TXL組脈搏血氧飽和度明顯升高(P0.05或P0.01)。 2通絡干預對急性缺氧兔缺氧耐受性的影響 2.1缺氧耐受時間的比較 從密閉缺氧到死亡,缺氧組家兔密閉缺氧耐受時間為(14.33±5.92)min,TXL組缺氧耐受時間為(22.63±4.75)min,在同一缺氧環(huán)境中延長生命達8min,兩組具有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。 2.2血氧分壓和血氧飽和度的變化比較 缺氧前缺氧組與TXL組血氧分壓和血氧飽和度無明顯差異(P0.05)。與缺氧前比較,缺氧組與TXL組兔在濃度為11.4%的低氧環(huán)境5min、30min、60min時,動脈血氧分壓及血氧飽和度均明顯降低(P0.01)。與缺氧組比較,TXL組動脈血氧分壓和血氧飽和度降低幅度明顯減小(P0.05或P0.01)。而密閉缺氧后,缺氧組與TXL組動脈血氧分壓和血氧飽和度均隨缺氧時間延長而下降,缺氧末(呼吸停止即刻)TXL組兔血氧分壓、血氧飽和度均明顯低于缺氧組(P0.01),顯示TXL不僅明顯延長了兔缺氧存活時間,同時在更低血氧濃度時才導致死亡,提高了耐低氧存活能力。 2.3血清HIF-1α的變化比較 HIF-1α為耐缺氧關鍵蛋白,與缺氧前比較,缺氧組與TXL組血清HIF-1α含量均明顯增加(P0.05或P0.01),顯示了實驗兔具有缺氧自適應調(diào)節(jié)能力;與缺氧組比較,TXL組血清HIF-1α含量增加尤為顯著(P0.05或P0.01),表明TXL通過增強HIF-1α蛋白表達而明顯提高了耐缺氧能力。 2.4主動脈組織HIF-1α、VEGF的變化比較 與對照組比較,缺氧組和TXL組主動脈組織HIF-1α和VEGF表達明顯增強(P0.05或P0.01)。而與缺氧組比較,TXL組主動脈組織HIF-1α表達增強,VEGF表達明顯增強(P0.05)。 3通絡干預對缺氧預適應小鼠缺氧耐受性作用機制研究 3.1兩組小鼠缺氧耐受時間的變化 兩組小鼠分別與第1次缺氧比較,隨著缺氧次數(shù)的增加,缺氧耐受時間均明顯增加(P0.05或P0.01)。而與對照組比較,TXL組各次的缺氧耐受時間明顯增加(P0.05或P0.01)。 3.2兩組小鼠腦組織HIF-1α、VEGF、Bax、Bcl-2蛋白表達的變化 缺氧前,對照組與TXL組小鼠腦組織有微量HIF-1α、VEGF、Bax表達,兩組之間無統(tǒng)計學意義(P0.05),Bcl-2有少量表達,TXL組表達高于對照組(P0.05)。 與缺氧前比較,對照組與通心絡組均隨缺氧次數(shù)增加,HIF-1α、VEGF、Bcl-2表達逐漸增強(P0.05或P0.01);Bax在缺氧1次表達明顯增強(P0.01),但在缺氧3次和缺氧5次逐漸降低,較缺氧1次組明顯減少(P0.05或P0.01);而與對照組比較,TXL組各次缺氧HIF-1α、VEGF、Bcl-2表達更加明顯(P0.05或P0.01),各次缺氧小鼠Bax表達明顯減弱(P0.05或P0.01)。 3.3兩組小鼠腦組織HIF-1α表達(免疫組化) 缺氧前,兩組小鼠大腦皮層神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞無明顯HIF-1α的陽性表達;隨缺氧次數(shù)的增加,兩組小鼠大腦皮層神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞HIF-1α的陽性表達逐漸增強;而與對照組比較,TXL組陽性表達明顯增強。 3.4 TXL對缺氧預適應小鼠腦皮層神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的作用 與正常對照組比較,缺氧組小鼠腦皮層內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變;與缺氧組比較,缺氧預適應組小鼠腦組織神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)改善;與缺氧預適應組比較,TXL組腦組織神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)明顯改善。 4 PI3K/Akt/HIF-1α信號通路在TXL提高HUVEC缺氧耐受性中的作用 4.1與正常對照組比較,缺氧組HUVEC增殖率顯著降低;與缺氧組比較,經(jīng)TXL處理后的缺氧+TXL組細胞增殖率明顯增高。HUVEC缺氧后細胞凋亡率明顯增高,隨缺氧時間的延長,細胞凋亡率逐漸增高;與缺氧組比較,經(jīng)TXL干預的缺氧+TXL組細胞凋亡率明顯降低。 4.2與缺氧對照組比較,利用DN-HIF抑制HIF-1α的表達后,缺氧HUVEC的存活率顯著下降,細胞凋亡率明顯升高,同時TXL提高細胞存活率和降低細胞凋亡率的水平明顯受到抑制,表明TXL提高HUVEC耐缺氧存活率和降低凋亡率的作用主要是由HIF-1α介導的。 4.3缺氧條件下,HUVEC細胞HIF-1α蛋白的表達明顯上調(diào),且隨缺氧時間的延長而增加。與對照組比較,應用TXL干預后,HIF-1α蛋白表達進一步增強。與對照質(zhì)粒組比較,HUVEC瞬轉(zhuǎn)PI3K的顯性負性突變體△p85后,HIF-1α蛋白表達顯著下調(diào),同時TXL誘導HIF-1α蛋白表達水平明顯被抑制。利用Akt的顯性負性突變體DN-Akt瞬轉(zhuǎn)HUVEC,也得出相同的結(jié)果。表明PI3K/Akt信號途徑介導了HIF-1α蛋白表達。 4.4缺氧條件下,HUVEC隨著缺氧時間的延長,P-Akt表達出現(xiàn)明顯變化,在缺氧4h增加,8h增加最明顯,24h有所減少。與對照組比較,經(jīng)TXL干預后P-Akt表達明顯增加。與對照質(zhì)粒比較,利用PI3K的顯性負性突變體△p85瞬時轉(zhuǎn)染后,P-Akt表達明顯減少;同時TXL誘導P-Akt表達水平明顯受到抑制。 結(jié)論: 1通絡干預可有效提高平原赴藏旅游人群和實驗動物的缺氧耐受性本研究以平原赴藏旅游人群、急性缺氧兔、缺氧預適應小鼠為研究對象,從臨床與基礎研究初步證實TXL可明顯降低赴藏旅游人群AMS發(fā)生率,提高急性缺氧兔密閉缺氧耐受時間,提高缺氧預適應小鼠缺氧耐受時間,表明TXL具有提高缺氧耐受性的作用。 2通絡干預通過增強缺氧自適應調(diào)節(jié)能力提高缺氧耐受性自適應是生物體作為復雜系統(tǒng)在長期進化過程中形成的適應環(huán)境延續(xù)生存的基本能力,實驗動物與平原赴藏旅游人群研究均顯示,隨缺氧時間延長,生命體可產(chǎn)生耐缺氧自適應調(diào)節(jié)能力,使缺氧損害明顯降低,赴藏旅游人群隨海拔高度增加AMS發(fā)生率逐漸增高,而隨缺氧時間的延長AMS發(fā)生率逐漸降低,動脈血氧分壓、動脈血氧飽和度、脈搏血氧飽和度明顯升高;缺氧預適應小鼠隨缺氧次數(shù)的增加,缺氧耐受時間逐漸延長。通絡干預可明顯調(diào)動缺氧自適應調(diào)節(jié)能力,提高赴藏旅游人群動脈血氧分壓、動脈血氧飽和度、脈搏血氧飽和度,增加缺氧預適應動物缺氧耐受時間,延長實驗動物密閉缺氧到死亡的存活時間,提高了耐低氧存活能力。 3促進HIF-1α蛋白表達是TXL提高缺氧自適應調(diào)節(jié)能力的核心作用機制,PI3K/Akt/HIF-1α信號通路為其主要途徑 對TXL提高缺氧耐受力及動物耐低氧存活能力的作用機制的深入研究證實:TXL可明顯促進實驗兔血清、主動脈和缺氧預適應小鼠腦組織HIF-1α表達,離體HUVEC實驗中利用DN-HIF抑制HIF-1α的表達后,缺氧HUVEC的存活率顯著下降,細胞凋亡率明顯升高,同時TXL提高細胞存活率和降低細胞凋亡率的作用明顯受到抑制,表明TXL提高缺氧耐受力的作用是由HIF-1α介導的。進一步實驗證實,PI3K/Akt/HIF-1α信號通路為其主要作用途徑。 4“承制調(diào)平”對揭示缺氧條件下機體代償性調(diào)節(jié)及治療轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在規(guī)律指導臨床防治具有重要理論指導意義 “承制調(diào)平”基于中醫(yī)陰陽五行學說概括出的脈絡學說核心理論,在不同層次上反映了中醫(yī)學的生理觀、病理觀、治療觀及預后觀,“承”揭示了人體不斷與自然界進行著物質(zhì)交換與信息交流,以維持機體內(nèi)外環(huán)境的和諧平衡,氧供需平衡的自穩(wěn)調(diào)控機制即屬“承”的范疇;“制”系指機體對病理損害的代償性自我調(diào)節(jié)機制,臨床與實驗研究顯示人體與動物均可在缺氧環(huán)境下提高自適應調(diào)節(jié)能力;由“調(diào)”致“平”的通絡干預,強調(diào)提高機體自適應調(diào)節(jié)重新恢復自穩(wěn)平衡態(tài),實驗證實通絡干預可明顯促進耐缺氧關鍵蛋白HIF-1α與VEGF以及抗凋亡因子Bcl-2的表達,抑制促凋亡因子Bax的表達,重建低氧環(huán)境下機體耐缺氧損傷的相對平衡態(tài),其關鍵機制為提高機體缺氧自適應調(diào)節(jié)能力,這對缺氧疾病治療具有重要的臨床應用價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2057602