本文選題：ALT_1 + B細(xì)胞抗原表位��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase)俗稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶,它是糖異生和氨基酸代謝過程中一個(gè)至關(guān)重要的酶,主要分布在肝臟組織中。當(dāng)肝組織損傷因?yàn)椴《拘愿窝�、非酒精性脂肪肝、肝硬化及藥物因素�(fù)p傷時(shí),肝細(xì)胞中的ALT釋放入血,使血清中ALT顯著增高。因此,在過去的50多年間,臨床上一直把血清中ALT作為反映肝功能的一個(gè)重要的生物標(biāo)志物。通過對血清中ALT的檢測,可以反映出肝臟功能是否損傷以及損傷的程度。 近年來發(fā)現(xiàn)人體中ALT有3種同功酶,ALT_1、ALT_2和ALT_2-2。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),ALT_1與ALT_2有著共同的催化活性,而ALT_2-2未發(fā)現(xiàn)有催化活性。ALT_1主要分布在肝臟、骨骼肌和腎臟組織中,亞細(xì)胞定位于胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng);ALT_2主要分布在心肌細(xì)胞和骨骼肌中,而在肝臟和腎臟組織中未見表達(dá),亞細(xì)胞定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在胞漿中不存在。因此,血清中ALT_1水平比總ALT能更特異的反應(yīng)肝臟功能狀態(tài)。 目前,臨床上對ALT的檢測主要是通過檢測總的ALT酶活性來完成的。這種方法雖然操作相對簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,但要依賴常規(guī)的生化檢測儀器,不能滿足在獻(xiàn)血現(xiàn)場對獻(xiàn)血員ALT的快速篩查。 我們擬建立基于免疫學(xué)診斷技術(shù)的檢測方法,對血清中ALT_1的實(shí)際含量進(jìn)行快速檢測,以滿足獻(xiàn)血現(xiàn)場對血源篩查的需要,并且可以更準(zhǔn)確、特異地反應(yīng)肝臟功能。為進(jìn)一步研發(fā)ALT_1免疫學(xué)體外診斷試劑奠定基礎(chǔ)。本課題擬制備出ALT_1特異的抗體。 目的: 原核表達(dá)截短的ALT_1蛋白,用它免疫新西蘭大白兔后,制備出特異的ALT_1多克隆抗體;用合成的表位肽免疫BALB/c小鼠,制備特異的ALT_1單克隆抗體。為研發(fā)ALT_1免疫學(xué)體外診斷試劑奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建ALT_1截短表達(dá)載體pCold-TF-ALT_1。 2.將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達(dá)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及SDS-PAGE分析表達(dá)形式后,用鎳離子親和層析法純化融合蛋白,再經(jīng)HRV-3C蛋白酶酶切后,應(yīng)用凝膠過濾法去除標(biāo)簽蛋白,進(jìn)而得到不帶標(biāo)簽的截短ALT_1蛋白。 3.通過B細(xì)胞抗原表位預(yù)測軟件分析ALT_1的抗原表位,綜合分析后,選取兩段肽MC-15和CK-17交予公司合成,并分別偶聯(lián)KLH以增加免疫原性。 4.用純化的截短ALT_1蛋白免疫新西蘭大白兔,制備ALT_1多克隆抗體。 5.用人工合成偶聯(lián)有KLH的MC-15、CK-17表位肽分別免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備ALT_1單克隆抗體。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建ALT_1的截短表達(dá)質(zhì)粒,通過PCR和雙酶切鑒定得到與預(yù)期大小一致的基因片段,同時(shí)通過基因測序分析證實(shí)完全一致,并無移碼突變。 2.通過鎳離子親和層析純化后得到較純的重組截短表達(dá)蛋白,融合蛋白再通過HRV-3C蛋白酶酶切后經(jīng)分子篩純化得到不帶標(biāo)簽的目的蛋白。 3.用純化的ALT_1截短表達(dá)蛋白免疫新西蘭大白兔后,制備出了特異性好、效價(jià)高的ALT_1多克隆抗體。 4.用人工合成偶聯(lián)有KLH的MC-15、CK-17表位肽免疫BALB/c小鼠,建立了多株穩(wěn)定分泌ALT_1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,通過腹水誘生法制備了腹水型ALT_1單克隆抗體,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法證明了腹水效價(jià)可達(dá)106,并可識別人血清中的ALT_1蛋白。 結(jié)論: 重組表達(dá)的截短融合蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化后,得到的融合蛋白再通過HRV-3C蛋白酶酶切后應(yīng)用分子篩得到目的蛋白,用此蛋白制備了ALT_1特異性的多克隆抗體;用合成的表位肽制備了特異性的單克隆抗體。為進(jìn)一步研發(fā)ALT_1免疫學(xué)體外診斷試劑奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:alanine aminotransferase ( alanine aminotransferase ) is commonly known as glutamic pyruvic transaminase , which is a crucial enzyme in the process of eogenesis and amino acid metabolism , and is mainly distributed in liver tissues .

ALT _ 1 , ALT _ 2 and ALT _ 2 - 2 were found in the liver , skeletal muscle and kidney tissues .

At present , the detection of ALT is mainly accomplished by detecting the total ALT activity . Although the method is relatively simple and accurate , it can not meet the routine biochemical detection instrument and can not meet the rapid screening of blood donors ALT in blood donation field .

In order to meet the need of blood source screening in blood donation field , we can establish the basis for further research and development of the in vitro diagnostic reagent for ALT _ 1 immunology .

Purpose :

The specific ALT _ 1 polyclonal antibody was prepared by immunizing BALB / c mice with synthetic epitope peptide , and the specific ALT _ 1 monoclonal antibody was prepared by immunizing BALB / c mice with synthetic epitope peptide .

Method :

1 . The expression vector pCold - TF - ALT _ 1 was constructed by molecular cloning .

2 . The expression vector was transformed into BL21 ( DE3 ) expression host bacteria . After IPTG induction and SDS - PAGE analysis , the fusion protein was purified by Ni ion affinity chromatography . After enzyme digestion with HRV - 3C protease , the labeled protein was removed by gel filtration , and then the label - free truncated ALT _ 1 protein was obtained .

3 . The epitope of ALT _ 1 was analyzed by B - cell antigen epitope prediction software . After comprehensive analysis , two segments of peptide MC - 15 and CK - 17 were selected to be delivered to the company for synthesis , and the immunogenicity was increased by coupling the peptide MC - 15 and CK - 17 respectively .

4 . immunizing New Zealand rabbits with purified truncated ALT _ 1 protein to prepare polyclonal antibody of ALT _ 1 .

5 . BALB / c mice were immunized with MC - 15 , CK - 17 peptide by artificial synthesis , and the monoclonal antibody of ALT _ 1 was prepared by hybridoma technique .

Results :

1 . The truncated expression plasmid of ALT _ 1 was constructed successfully , and the gene fragment consistent with the expected size was obtained by PCR and double - enzyme digestion .

2 , purifying by nickel ion affinity chromatography to obtain a pure recombinant truncated expression protein , and then carrying out molecular sieve purification on the fusion protein through the HRV - 3C protease to obtain the target protein without label .

3 . After immunizing New Zealand rabbits with purified ALT _ 1 , the polyclonal antibody with high specificity and high titer was prepared .

4 . BALB / c mice were immunized with MC - 15 , CK - 17 epitope peptide by artificial synthesis . The hybridoma cell line secreting ALT _ 1 monoclonal antibody was established . The ascites - type ALT _ 1 monoclonal antibody was prepared by the ascites - induced method . The indirect enzyme - linked immunosorbent assay demonstrated that the titer of ascites was up to 106 , and the serum ALT _ 1 protein could be identified .

Conclusion :

After the recombinant expression truncated fusion protein was purified by nickel ion affinity chromatography , the obtained fusion protein was digested with HRV - 3C protease and then the target protein was obtained by using molecular sieve . The polyclonal antibody specific for ALT _ 1 was prepared by using the protein . The specific monoclonal antibody was prepared by the synthesized epitope peptide .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：2051009