發(fā)布時間：2018-06-21 07:53

  本文選題：犬新孢子蟲 + NcSRS2-NcGRA7　； 參考：《延邊大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：新孢子蟲病是嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要繁殖障礙性疾病,該病可垂直傳播,帶蟲母牛可將蟲體直接傳給新生犢牛,隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牛的頻繁交易,該病在我國的流行區(qū)域逐漸擴大。目前,國內(nèi)外對新孢子蟲病的研究都局限在病原學(xué)、分子生物學(xué)、流行病學(xué)、診斷和免疫學(xué)方面,但對新孢子蟲病的防控尚無有效的方法。因此,本研究提取牛源犬新孢子蟲基因組DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)擴增牛源犬新孢子蟲表面蛋白基因NcSRS2和致密顆粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技術(shù)拼接NcSRS2和NcGRA7基因,構(gòu)建NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組克隆質(zhì)粒、重組真核質(zhì)粒、重組腺病毒穿梭質(zhì)粒及重組腺病毒,制備NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗和重組腺病毒疫苗,應(yīng)用Prime-Boost免疫策略及單一疫苗分別接種BABL/c小鼠,測定體液免疫和細胞免疫應(yīng)答水平,并進行攻蟲試驗,評價免疫保護性,以期為牛的新孢子蟲病新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 1、牛源犬新孢子蟲NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因的克隆與生物信息學(xué)分析 提取牛源犬新孢子蟲基因組DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)擴增犬新孢子蟲表面蛋白基因NcSRS2和致密顆粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技術(shù)拼接NcSRS2和NcGRA7基因,構(gòu)建NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組克隆質(zhì)粒,并進行PCR鑒定、雙酶切鑒定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果,NcSRS2基因擴增片段大小為1061bp,NcGRA7基因擴增片段大小為364bp, NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因擴增片段大小為1482bp；獲得重組克隆質(zhì)粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定正確；測序分析表明,與GenBank中已發(fā)表的美國株犬新孢子蟲(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性為99%；經(jīng)DNAman等軟件分析,預(yù)測NcSRS2-NcGRA7復(fù)合蛋白抗原指數(shù)較高,復(fù)合蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主,三級結(jié)構(gòu)中兩種蛋白獨立折疊,并借助Linker互相連接,功能互不影響。 2、NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗的構(gòu)建 重組克隆質(zhì)粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7與pVAX1真核表達載體同時進行EcoRI XbaI雙酶切后,構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pVAXl-NcSRS2-NcGRA7,將PCR鑒定和酶切鑒定正確的重組真核表達質(zhì)粒脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Vero細胞,應(yīng)用RT-PCR、IFAT及Western blotting技術(shù)鑒定pVAX1-NcSRS2-NcGRA7重組質(zhì)粒在Vero細胞中的表達。結(jié)果,構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確,并能夠在Vero細胞中表達。擴增、純化重組質(zhì)粒制備NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗。 3, NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組腺病毒疫苗的構(gòu)建 重組克隆質(zhì)粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切后,亞克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭載體pCR259中,構(gòu)建pCR259-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒穿梭質(zhì)粒,將PCR鑒定和酶切鑒定正確的pCR259-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒穿梭質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受態(tài)細胞,進行同源重組與純化,構(gòu)建NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因重組腺病毒表達質(zhì)粒,PacⅠ酶切線性化后,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染QBI-HEK293細胞包裝Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒。結(jié)果,經(jīng)PCR檢測,構(gòu)建的重組腺病毒含有NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因；經(jīng)IFAT和Western blotting檢測,NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因在QBI-HEK293細胞中獲得表達。測得Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒滴度為109TCID50/mL。 4、NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因疫苗的Prime-Boost免疫策略研究 80只BALB/c小鼠隨機分為4組,每組20只,分別為Prime-Boost免疫策略組(核酸疫苗初免,重組腺病毒疫苗二免、三免)、Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組。每隔2W肌肉注射接種一次,共接種3次,每次免疫前及三免后2W、4W、6W分別斷尾采血(三免2W后攻蟲小鼠除外),分離血清。ELISA測定IgG、IgG1、IgG2a抗體水平；流式細胞術(shù)檢測三免2W后每組5只BALB/c小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群變化；ELISA試劑盒檢測細胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α水平,以及血清中N0濃度。結(jié)果： 抗體水平：三免后,IgG OD410,值Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組(p0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組(p0.01)及PBS對照組(p0.01)；IgG1濃度Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組比較,差異不顯著(p0.05),而與pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組比較,差異顯著(p0.05)；IgG2a濃度Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組(p0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組(p0.01)及PBS對照組(p0.01)。 T淋巴細胞亞群變化：三免2W后,CD4+T細胞數(shù)量Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組比較,差異顯著(p0.05),而與PBS對照組比較,差異極顯著(p0.01)；CD8+T細胞數(shù)量Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組比較,差異不顯著(P50.05),與PBS對照組比較,差異顯著(p0.05)；CD4+/CD8+比值Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-.NcGRA7重組腺病毒疫苗組比較,差異顯著(p0.05),而與pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組比較,差異極顯著(p0.01)。 細胞因子水平：三免后,IFN-γ濃度Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組(p0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組(p0.01)及PBS對照組(p0.01)；IL-4濃度Prime-Boost免疫策略組顯著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組(p0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組(p0.05)及PBS對照組(p0.01)；TNF-α濃度Prime-Boost免疫策略組與Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組比較,差異不顯著(p0.05),而與pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組及PBS對照組比較,差異顯著(p0.05)。 血清中NO濃度：三免后,N0濃度Prime-Boost免疫策略組略高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組,差異不顯著(p0.05),與PVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組比較,差異顯著(p0.05),與PBS對照組比較,差異極顯著(p0.01)。 5、NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因疫苗的免疫保護性評價 三免2W后,每個試驗組各取10只BABL/c小鼠,每只腹腔攻擊犬新孢子蟲速殖子106個,攻蟲后觀察小鼠的臨床癥狀并統(tǒng)計存活率；攻蟲4W后,脫頸處死存活的BABL/c小鼠,病理解剖學(xué)觀察各主要臟器的外觀變化,病理組織學(xué)H.E染色和免疫組織化學(xué)觀察腦組織、肝、脾等臟器的病理組織學(xué)變化及蟲體定位,PCR方法檢測腦組織、肝、脾等臟器中犬新孢子蟲Nc-5基因。結(jié)果,攻蟲4W后的BALB/c小鼠,Prime-Boost免疫策略組和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗組的存活率均為100%,未出現(xiàn)明顯臨床癥狀,主要器官組織均無明顯病理變化和蟲體存在,PCR檢測各器官組織中犬新孢子蟲Nc-5基因均為陰性；pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗組的存活率為60%,攻蟲后第7d出現(xiàn)精神沉郁、后肢麻痹等臨床癥狀,主要器官組織以泛發(fā)型充血、出血為特征,腦、肝、脾組織中發(fā)現(xiàn)犬新孢子蟲包囊或速殖子,PCR檢測心、肝、脾、肺及腦組織中犬新孢子蟲Nc-5基因陽性；而PBS對照組的存活率為20%,攻蟲后第3d出現(xiàn)聳毛、怠惰、四肢癱瘓等臨床癥狀,各器官組織以泛發(fā)型充血、出血為特征,腦、肝、脾組織中發(fā)現(xiàn)犬新孢子蟲速殖子,PCR檢測心、肝、脾、肺、腎及腦組織中犬新孢子蟲Nc-5基因陽性。綜合各試驗組BALB/c小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體、細胞因子等水平以及攻蟲后的整體變化評價,四個試驗組中Prime-Boost免疫策略組優(yōu)勢顯著,該策略適用于新孢子蟲病的防控。 結(jié)論： 1、應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)成功拼接了NcSRS2和NcGRA7基因,拼接復(fù)合基因的大小為1482bp,并對NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因進行了克隆和生物信息學(xué)分析。 2、構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7,該質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染Vero細胞獲得表達,并制備了pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗。 3、成功構(gòu)建了滴度為109TCID50/mL的Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒,并制備了Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗。 4、建立的Prime-Boost免疫策略與單疫苗比較,能夠顯著提高BALB/c小鼠的體液免疫水平和細胞免疫水平 5、Prime-Boost免疫策略和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重組腺病毒疫苗對攻蟲4W后的BALB/c小鼠均有100%的免疫保護率。 6、綜合攻蟲前后BALB/c小鼠的整體變化評價,Prime-Boost免疫策略組顯著優(yōu)于其他各組,該策略有助于新孢子蟲病的防控。
[Abstract]:The NcSRS2 and NcGRA7 genes were amplified by PCR . The NcSRS2 and NcGRA7 genes were amplified by PCR . The NcSRS2 - NcGRA7 composite gene was amplified by PCR . The recombinant plasmid , recombinant eukaryotic plasmid , recombinant adenovirus shuttle plasmid and recombinant adenovirus were used to prepare NcSRS2 - NcGRA7 composite gene nucleic acid vaccine and recombinant adenovirus vaccine .

Cloning and Bioinformatic Analysis of the NcSRS2 - NcGRA7 Composite Gene from the New Sporozoites of the Cattle

The NcSRS2 and NcGRA7 genes were amplified by PCR , NcSRS2 and NcGRA7 genes were amplified by PCR . The results showed that the size of NcSRS2 - NcGRA7 gene was 1061bp , the size of NcGRA7 gene was 364bp , and the size of NcSRS2 - NcGRA7 compound gene was 1482bp .
The recombinant clone plasmid pMD18 - NcSRS2 - NcGRA7 was obtained by PCR and identified by PCR .
Sequencing analysis showed that the nucleotide sequence identity of AF061249 and AF176649 was 99 % .
By DNAman and other software analysis , it is predicted that the NcSRS2 - NcGRA7 composite protein antigen index is high , the secondary structure of the complex protein is mainly alpha - helix and beta - fold , the two proteins in the three - stage structure are folded independently , and the function is not affected by the mutual connection of Linker .

2 . Construction of NcSRS2 - NcGRA7 compound gene nucleic acid vaccine

The recombinant eukaryotic expression plasmid pMD18 - NcSRS2 - NcGRA7 was constructed by RT - PCR , IFAT and Western blotting .

Construction of recombinant adenovirus vaccine of NcSRS2 - NcGRA7 composite gene

The recombinant adenovirus shuttle plasmid pCR259 - NcSRS2 - NcGRA7 was transformed into high Q - 1Transpose - AdTM294 and HighQ - 1TM competent cells . The recombinant adenovirus plasmid pCR259 - NcSRS2 - NcGRA7 was transformed into high Q - 1Transpose - AdTM294 and HighQ - 1TM competent cells .
The expression of NcSRS2 - NcGRA7 gene was detected by IFAT and Western blotting . The recombinant adenovirus titer of Ad5 - NcSRS2 - NcGRA7 was 10950 / mL .

4 銆，

本文編號：2047808