本文選題：自噬 + 血管內(nèi)皮細胞　； 參考：《山東大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：巨自噬(以下簡稱自噬)是真核細胞中一種保守的溶酶體依賴的降解機制。胞質(zhì)中內(nèi)源性的長壽命蛋白和多余或異常的細胞器被雙層膜包被,形成泡狀結(jié)構(gòu),稱為自噬小體。后者與溶酶體或內(nèi)體發(fā)生質(zhì)膜融合。自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autophagolysosome),溶酶體酸性水解酶將自噬溶酶體的內(nèi)膜和包含物降解成氨基酸、單糖、核苷酸等小分子,被細胞重新利用,從而實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和受損細胞器的清除。這一過程不僅僅為細胞的基礎(chǔ)功能提供養(yǎng)料,同時在抵抗微生物侵入、蛋白錯誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、氧化壓力過程中提高細胞適應(yīng)性促進存活。另一方面,自噬還是一種細胞死亡方式,稱為Ⅱ型程序性細胞死亡,它有利于保護細胞內(nèi)環(huán)境,清除有害物質(zhì),維持機體穩(wěn)定和更新。越來越多的實驗證據(jù)表明自噬參與許多重大疾病,包括神經(jīng)退行性病變、腫瘤、動脈粥樣硬化和老化等,因此自噬研究具有極為重要的病理生理學(xué)意義。 血管內(nèi)皮細胞是覆蓋在血管內(nèi)膜表面并且相互緊密連接的單層細胞,它有效地將血液和血管壁分隔開來。血管內(nèi)皮細胞具有信息傳遞、內(nèi)分泌、參與凝血、炎癥反應(yīng)和血管生成等多種重要的生理功能。因內(nèi)皮細胞功能紊亂而引起的高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭、腦卒中等疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。維持內(nèi)皮細胞正常功能具有重大臨床意義。目前越來越多的研究關(guān)注于自噬及其調(diào)控在血管內(nèi)皮細胞正常生理功能中發(fā)揮的作用,那么血管內(nèi)皮細胞自噬的內(nèi)在分子機制是什么?啟動血管內(nèi)皮細胞自噬的分子開關(guān)到底有哪些?它們是否參與經(jīng)典的自噬信號通路呢?這些都有待于進一步深入研究。 膜聯(lián)蛋白(Annexins)是廣泛存在于動植物中的一類Ca2+調(diào)節(jié)的,與帶負電荷膜磷脂相結(jié)合的一類保守的蛋白超家族。在細胞中參與膜轉(zhuǎn)運和膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動,包括囊泡運輸、胞吐作用中的質(zhì)膜融合、信號傳導(dǎo)和鈣離子通道的形成、炎癥反應(yīng)、細胞分化和細胞骨架蛋白間的相互作用等。目前已知Annexin家族成員約有20多種,分A、B、C、D、E五大類。所有Annexin超家族成員均具有一個保守的中心結(jié)構(gòu)域(core domain)和一個發(fā)揮各自獨特功能的N端結(jié)構(gòu)域。其中心結(jié)構(gòu)域為含有重復(fù)序列的保守結(jié)構(gòu),由4個同源的重復(fù)序列(annexin A6含有8個同源的重復(fù)序列)組成,每個重復(fù)序列含有70-80個氨基酸殘基組成的5個α螺旋,排列成彎曲的盤狀。Annexin的N端均含有鈣結(jié)合蛋白s100蛋白家族共有的鈣結(jié)合位點和磷酸化位點。腫瘤抑制基因annexin A7 (ANXA7)定位與染色體10q21上,轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過不同的剪切形成兩種異形體,分子量分別是47kD和51 kD。ANXA7與鈣離子和磷脂結(jié)合發(fā)揮Ca2+激活的GTPase活性參與質(zhì)膜融合。二型肺泡細胞在分泌表面活性物質(zhì)時需要片層體與細胞質(zhì)膜融合。信號脂類,如甘油二脂(DAG)和磷脂酰肌醇-4,5二磷酸(PIP2)可以調(diào)節(jié)ANXA7的質(zhì)膜融合特性。分離的片層體用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)或磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)處理后,ANXA7的融合活性明顯增強。 本論文利用化學(xué)遺傳學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法,研究血管內(nèi)皮細胞自噬的調(diào)控,探討膜聯(lián)蛋白ANXA7在內(nèi)皮細胞自噬中的作用,并進一步揭示ANXA7在自噬調(diào)控中的分子機理。從而深化對血管內(nèi)皮細胞自噬機制的認識,為自噬調(diào)控提供新的有效的工具,并為臨床診療新策略提供科學(xué)的理論依據(jù)。 研究內(nèi)容 1.在去除血清和生長因子條件下低濃度鎘離子(Cd2+,10μM)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)自噬并抑制細胞凋亡作用。 2.低濃度鎘離子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞自噬的作用機理。 3.苯并VA嗪衍生物ABO誘導(dǎo)正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬。 4.ANXA7在ABO誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞自噬中的作用。 5.ABO參與自噬調(diào)控的分子機理。 研究方法 1.血管內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)：參考Jaffe等的方法(Jaffe et al.,1973)。 2.細胞自噬和自噬流的檢測： 1)吖啶橙染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細胞中酸性膜泡的數(shù)量及分布。 2)吖啶橙染色結(jié)合流式細胞技術(shù)檢測細胞中酸性膜泡的數(shù)量。 3)免疫細胞化學(xué)法檢測自噬標(biāo)志物MAP1 LC3蛋白在細胞內(nèi)的定量和分布。 4)利用Western blot法檢測LC3-Ⅱ、beclin1和p62的蛋白水平分析自噬小體的數(shù)量以及自噬流的完整性。 5)利用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin誘導(dǎo)自噬以檢測ABO引發(fā)的自噬和自噬流。 6)利用自噬抑制劑3MA、bafilomycin A1以檢測ABO引發(fā)的自噬和自噬流。 7)利用Western blot法檢測mTOR信號通路的下游靶點p70S6K和4EBP1的磷酸化情況。 3.細胞凋亡檢測： 1)倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。 2)吖啶橙染色結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞核凝集及片斷化。 3)利用TUNEL方法檢測細胞凋亡率。 4.磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)活性檢測：參考吳興中等人的方法(Wu et al.,1997)。 5.利用RNA干擾技術(shù)降低蛋白表達水平：利用化學(xué)合成的siRNA特異性阻斷血管內(nèi)皮細胞中ANXA7的表達。 6.利用真核細胞過表達系統(tǒng)特異性上調(diào)蛋白表達： 1)利用含annexin A7全長的表達載體pCMV6-XL5-ANXA7特異性上調(diào)血管內(nèi)皮細胞中ANXA7的蛋白表達水平。 2)免疫細胞化學(xué)染色法檢測細胞內(nèi)ANXA7蛋白水平。 3)Western blot法檢測細胞內(nèi)ANXA7蛋白水平。 7.活性氧(ROS)檢測：利用熒光探針DCHF結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ROS水平。 8.線粒體膜電位(MMP)檢測：利用熒光探針JC-1結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測MMP水平。 9.細胞內(nèi)蛋白表達水平及分布檢測： 1)利用免疫細胞化學(xué)染色法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ANXA7、膜整聯(lián)蛋白integrinβ4、caveolin-1的蛋白表達水平及分布。 2)利用RT-PCR方法檢測細胞內(nèi)ANXA7、GAPDH的mRNA水平。 3)利用Western blot方法檢測LC3、beclinl、p62、ANXA7、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1、GAPDH、β-actin的蛋白表達水平 研究結(jié)果 1.低濃度鎘離子(Cd2+)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞自噬并抑制因去除血清和生長因子引起的細胞凋亡 1.1利用熒光探針檢測鎘離子進入血管內(nèi)皮細胞的數(shù)量。結(jié)果顯示細胞中熒光強度隨鎘離子的濃度升高而升高,具有明顯的劑量依賴性。單純探針本身僅顯示微弱的熒光信號(圖1-1)。 1.2倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示1、5、10μM鎘離子處理24h有效地減弱了由于去除血清和生長因子引起的內(nèi)皮細胞從培養(yǎng)皿上脫離(圖1-2)。 1.3 TUNEL實驗結(jié)果表明去除血清和生長因子明顯引發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡,細胞核出現(xiàn)碎裂。鎘離子處理后TUNEL陽性率明顯降低,但10μM鎘離子的作用有所減弱,TUNEL陽性率出現(xiàn)一定的回升(圖1-3)。 1.4在去除血清和生長因子條件下,吖啶橙染色顯示低濃度的鎘離子引起細胞內(nèi)的酸性膜泡增多(圖1-4),提示細胞自噬增強的可能性。 1.5 Western blot結(jié)果表明自噬標(biāo)記物MAP1 LC3-Ⅱ的蛋白含量增多(圖1-5),表明自噬小體增多,自噬增強。 2.低濃度鎘離子(Cd2+)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞自噬并抑制其凋亡的分子機制研究 2.1分別用0、1、5、10μM鎘離子處理用不含血清和生長因子培養(yǎng)液培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞4 h,接著用DCHF熒光探針檢測細胞中的ROS水平。結(jié)果顯示5、10μM鎘離子處理的血管內(nèi)皮細胞中探針熒光強度增強,細胞ROS水平升高(圖1-6)。 2.2在去除血清與生長因子的條件下,免疫細胞化學(xué)染色檢測結(jié)果表明低濃度的鎘離子降低了內(nèi)皮細胞整聯(lián)蛋白integrinβ4的含量,隨著鎘離子濃度的增高integrinβ4降低程度逐漸增加,呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1-7)。 2.3免疫細胞化學(xué)染色方法檢測細胞內(nèi)小窩蛋白caveolin-1的表達水平,不同濃度的鎘離子明顯降低caveolin-1水平,其中5μM鎘離子效果最顯著(圖1-8)。 2.4在去除血清與生長因子的條件下,不同濃度的鎘離子明顯降低細胞內(nèi)PC-PLC活性,其中5μM鎘離子效果最顯著(圖1-9)。 3.苯并VA嗪衍生物ABO誘導(dǎo)正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬 3.1應(yīng)用不同濃度的苯并VA嗪衍生物ABO (10、25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細胞24h,吖啶橙染色結(jié)果顯示胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡增多。提前加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)處理抑制50μM ABO引起的酸性膜泡數(shù)量增多(圖2-2A)。用流式細胞儀檢測表明ABO將細胞內(nèi)的吖啶橙熒光強度由對照組的3%左右提高到50%以上(圖2-2B)。 3.2小分子ABO處理血管內(nèi)皮細胞24小時,將細胞固定后制成切片應(yīng)用于透射電鏡觀察。ABO處理組中直徑500nm左右的雙層膜泡數(shù)量增多(圖2-3,*所示),表明自噬小體增多。自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理相對減少了雙層膜結(jié)構(gòu)的數(shù)量,進一步確證該雙層膜結(jié)構(gòu)為自噬小體。 3.3利用免疫細胞化學(xué)染色方法檢測血管內(nèi)皮細胞中的自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (MAPI LC3)。ABO (25、50、100μM處理血管內(nèi)皮細胞24h后細胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯點狀簇集,表明LC3轉(zhuǎn)移到自噬小體膜上,提示自噬小體形成。自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理有效減少了LC3陽性膜泡的數(shù)量,抑制ABO誘導(dǎo)的自噬作用(圖2-4)。 3.4小分子ABO (25、50、100μM處理血管內(nèi)皮細胞24 h后提取細胞全蛋白,Western blot方法檢測LC3和自噬底物p62/SQSTM1的蛋白水平。隨著ABO濃度升高,與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合的LC3-Ⅱ的含量逐漸升高,自噬底物p62的降解增加,細胞內(nèi)含量減少。自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理有效抑制LC3-Ⅱ的上調(diào)和p62的下調(diào)(圖2-5)。 3.5利用50μM ABO處理血管內(nèi)皮細胞0、6、12、24 h后提取細胞全蛋白檢測LC3的蛋白水平,利用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)作為陽性對照。在此時間區(qū)段中,隨著時間的延長細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的含量逐漸升高,在24h達到相對最高值(圖2-6)。 3.6小分子ABO (25、50、100μM處理血管內(nèi)皮細胞24h后提取細胞全蛋白,Western blot方法檢測自噬另一標(biāo)志性蛋白beclin1的水平。結(jié)果顯示beclinl蛋白被小分子ABO上調(diào),該作用可以被自噬抑制劑3-MA抑制(圖2-7)。 3.7利用巴弗洛霉素A1 (bafilomycin A1)抑制自噬溶酶體中蛋白酶的活性而阻斷自噬流,進一步加入501μM小分子化合物ABO處理24h,結(jié)果顯示ABO可以進一步增強巴弗洛霉素A1對LC3-Ⅱ的積累作用,說明ABO不是阻斷自噬小體的降解,而是促進自噬小體的生成(圖2-8)。 4.膜聯(lián)蛋白ANXA7在ABO誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞自噬中的作用 4.1小分子ABO (25、50、100μM處理血管內(nèi)皮細胞24h后提取細胞全蛋白,Western blot方法檢測膜聯(lián)蛋白ANXA7的水平。隨著ABO濃度升高,ANXA7的蛋白水平被逐漸上調(diào)(圖2-9A)。利用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)方法檢測mRNA水平,結(jié)果顯示ABO提高ANXA7的基因表達水平(圖2-9B)。用50μM ABO處理血管內(nèi)皮細胞0、6、12、24h后ANXA7蛋白水平升高,并呈現(xiàn)出時間依賴趨勢(圖2-9C)。利用免疫細胞化學(xué)染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)50μM小分子ABO處理血管內(nèi)皮細胞24h后ANXA7在細胞內(nèi)含量升高,且呈現(xiàn)出點狀簇集分布的狀態(tài)(圖2-9D)。 4.2利用不同濃度的ANXA7特異性干擾RNA (siANXA7,10.20.40 nM)處理血管內(nèi)皮細胞24、48、72h,免疫細胞化學(xué)染色顯示ANXA7的表達被有效抑制。在隨后的實驗中選擇40nM處理24h作為實驗條件(圖2-10A)。利用不同濃度的siANXA7 (10.20.40 nM)處理血管內(nèi)皮細胞24 h后提取全蛋白,Western blot檢測ANXA7蛋白水平。隨著siANXA7濃度的增高,ANXA7蛋白水平逐漸降低,其中40nM效果最明顯,確證該實驗條件有效干擾細胞內(nèi)ANXA7蛋白表達(圖2-10B)。 4.3通過免疫細胞化學(xué)染色結(jié)合RNA干擾技術(shù)(RNAi)研究膜聯(lián)蛋白ANXA7和自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的定位情況。血管內(nèi)皮細胞分別用無意義RNA (scramble RNA, Scr). ANXA7特異性干擾RNA (siANXA7)處理后,先后使用LC3和ANXA7抗體標(biāo)記兩種蛋白。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示：在對照組和無意義RNA處理組,ABO處理血管內(nèi)皮細胞24h后LC3出現(xiàn)點狀簇集,同時胞質(zhì)內(nèi)ANXA7與LC3發(fā)生一定的共定位。而將ANXA7干擾掉之后,LC3點狀簇集的數(shù)量明顯減少。結(jié)果表明ANXA7在ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞自噬中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖2-11)。 4.4利用40nM ANXA7特異性干擾RNA (siANXA7)處理血管內(nèi)皮細胞24 h,不同濃度小分子ABO (25、50、100μM繼續(xù)處理24h。吖啶橙染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：在對照組和無意義RNA處理組,ABO處理血管內(nèi)皮細胞24h,細胞內(nèi)酸性膜泡數(shù)量明顯增多,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴趨勢。將ANXA7干擾掉之后,ABO處理細胞的酸性膜泡數(shù)量相對減少(圖2-12)。 4.5利用40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理24 h, ABO(50μM)繼續(xù)處理血管內(nèi)皮細胞24h后提取細胞全蛋白,Western blot方法檢測ANXA7和LC3-Ⅱ蛋白含量。結(jié)果顯示在無意義RNA組中ABO明顯上調(diào)ANXA7和自噬蛋白LC3-Ⅱ的蛋白含量；在siANXA7組中ANXA7含量減少,同時LC3-Ⅱ的蛋白含量相對明顯減少。表明ANXA7在ABO誘導(dǎo)的自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖2-13)。 4.6利用蛋白質(zhì)過表達系統(tǒng)研究ANXA7過表達對自噬的影響。血管內(nèi)皮細胞分別用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000,空質(zhì)粒pCMV6-XL5,帶有ANXA7全長序列的pCMV6-XL5-ANXA7質(zhì)粒處理后提取細胞全蛋白,Western blot方法檢測ANXA7和LC3-Ⅱ的蛋白含量。結(jié)果顯示pCMV6-XL5-ANXA7處理組中ANXA7含量增高,LC3-Ⅱ含量明顯升高。空質(zhì)粒組中LC3-Ⅱ含量輕微升高,可能與空質(zhì)粒刺激細胞產(chǎn)生一定的細胞反應(yīng)有關(guān)(圖2-14)。 5.膜聯(lián)蛋白ANXA7調(diào)控的自噬不參與經(jīng)典的mTOR信號通路 5.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細胞24h提取細胞全蛋白,Western blot方法檢測經(jīng)典的自噬信號通路哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)的下游分子p70S6K和4EBP1的磷酸化。雷帕霉素可以減低二者的磷酸化水平,從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。Western blot結(jié)果顯示ABO處理后p70S6K和4EBP1的磷酸化狀態(tài)沒有改變(圖2-15A)。用50μMABO處理血管內(nèi)皮細胞0、6、12、24h后提取細胞全蛋白,Western blot結(jié)果顯示在此時間區(qū)間p70S6K和4EBP1的磷酸化狀態(tài)沒有改變(圖2-15B)。表明ABO和ANXA7誘導(dǎo)的自噬是不依賴于mTOR信號通路的。 5.2分別用Scramble RNA和40nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理24h,加入雷帕霉素處理血管內(nèi)皮細胞8h,提取細胞全蛋白檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ和自噬底物p62的蛋白水平。雷帕霉素處理的對照組、無意義RNA組和siANXA7組中,雷帕霉素均可以明顯提高LC3-Ⅱ,降低p62的水平,說明ANXA7不參與雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬(圖2-16)。 6.苯并VA嗪衍生物ABO處理內(nèi)皮細胞后ROS. MMP沒有變化 6.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細胞24 h,利用熒光探針DCHF檢測活性氧(ROS)變化。結(jié)果顯示ABO不影響細胞內(nèi)ROS水平(圖2-17A)。與ABO相反,小分子DBO (6,8-dichloro-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-1, 4-benzoxazine)提高細胞內(nèi)ROS水平。ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)先處理可以有效抑制ROS水平的升高(圖2-17B)。Western blot檢測結(jié)果表明：NAC清除細胞內(nèi)ROS后,DBO誘導(dǎo)的自噬被明顯抑制,說明小分子DBO是通過ROS誘導(dǎo)細胞自噬的(圖2-17C)。 6.2小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細胞24h,利用熒光探針JC-1檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABO不影響細胞內(nèi)線粒體膜電位水平(圖2-18)。 結(jié)論： 1.低濃度鎘離子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬,抑制因去除血清和生長因子而誘發(fā)的凋亡作用。此過程中ROS水平升高, integrinβ4、caveolinl水平和PC-PLC活性降低。 2.苯并VA嗪衍生物ABO激活血管內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬作用。 3.苯并VA嗪衍生物ABO通過上調(diào)膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)的水平激活自噬,ANXA7在ABO誘導(dǎo)的HUVEC自噬過程中是充分而且必要的條件。 4.苯并VA嗪衍生物ABO激活的自噬作用是不依賴于哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)信號通路的。ANXA7不參與雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬。 5.苯并VA嗪衍生物ABO激活的自噬不依賴于活性氧(ROS)水平,而DBO激活的自噬依賴于ROS水平的升高。 6.苯并VA嗪衍生物ABO不影響細胞內(nèi)線粒體膜電位。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【共引文獻】

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4 程軼U，

本文編號：2038526