本文選題：降鈣素基因相關(guān)肽 + 高氧癥�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：背景 較高濃度和較長時(shí)間的持續(xù)氧療可導(dǎo)致急性肺損傷（ALI）或支氣管肺發(fā)育不良（BPD），嚴(yán)重威脅新生兒健康。目前對于ALI和BPD國內(nèi)外均無確定有效的防治方法，但研究顯示其病因與肺的發(fā)育成熟及肺損傷的異常修復(fù)密切相關(guān)。肺的彌漫性非特異性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致氣道重塑和肺泡纖維化是其最主要危險(xiǎn)因素和最終病理特征。理想中的肺損傷修復(fù)是由原來性質(zhì)的細(xì)胞來修復(fù)，并恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)和功能，而不是由成纖維細(xì)胞增殖替代正常組織結(jié)構(gòu)。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞功能，可分化為Ⅰ型肺泡（AECⅠ）上皮細(xì)胞，但其自身增殖能力差，成為肺結(jié)構(gòu)正常修復(fù)的障礙。CGRP是具有廣泛調(diào)節(jié)功能的神經(jīng)肽，其在肺損傷修復(fù)中的功能成為目前研究的熱點(diǎn)。而Sonichedgehog （Shh）信號通路是與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。通過神經(jīng)肽干預(yù)Shh信號通路從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外誘導(dǎo)AECⅡ增殖重建，有可能會成為高氧肺損傷研究方面基礎(chǔ)理論創(chuàng)新與解決臨床實(shí)際問題相結(jié)合的新切入點(diǎn)。 目的 1建立實(shí)驗(yàn)用原代早產(chǎn)大鼠AECⅡ模型，進(jìn)一步探索分離純化和培養(yǎng)方法，為后續(xù)高氧誘導(dǎo)AECⅡ損傷和CGRP干預(yù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對氧體積分?jǐn)?shù)大于95%暴露下的早產(chǎn)大鼠AECⅡ的影響及其意義。 3研究CGRP對高氧誘導(dǎo)AECⅡ損傷的保護(hù)作用是否涉及Shh信號通路，觀察該信號通路中Smo和Gli1信號分子的改變。 4探討CGRP對高氧誘導(dǎo)的新生大鼠的肺組織損傷的保護(hù)作用。 5研究Shh信號通路中Smo和Gli1蛋白在高氧誘導(dǎo)的新生大鼠急性肺損傷中的表達(dá)及其意義。 方法 1孕19d SPF級SD大鼠經(jīng)麻醉后，剖宮產(chǎn)取出胎鼠，提取肺臟，剪碎，先后用胰蛋白酶聯(lián)合DNA酶和膠原酶Ⅰ消化肺組織，分離肺臟細(xì)胞。采用差速離心和差速貼壁的方法純化AECⅡ，然后以DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(胎牛血清濃度為10%)。臺盼藍(lán)染色檢測AECⅡ活力，改良巴氏染色檢測AECⅡ純度，透射電鏡鑒定AECⅡ，倒置相差顯微鏡觀察AECⅡ生長情況。 2早產(chǎn)大鼠原代AECⅡ分離純化后，隨機(jī)分為空氣組、空氣+CGRP組、空氣+CGRP+CGRP8-37組、高氧組、高氧+CGRP組、高氧+CGRP+CGRP8-37組�？諝饨M室內(nèi)空氣條件培養(yǎng)，高氧組給予氧體積分?jǐn)?shù)大于95%的氧氣培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后觀察AECⅡ的形態(tài)變化，檢測細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測表面活性蛋白C（SPC）mRNA表達(dá)。 3分離純化的早產(chǎn)大鼠原代AECⅡ，隨機(jī)分為空氣組、高氧組、高氧+CGRP組、高氧+CGRP+CGRP8-37組。培養(yǎng)24h后RT-qPCR檢測培養(yǎng)細(xì)胞的Smo和Gli1mRNA表達(dá)水平，用Western blot方法檢測Smo和Gli1蛋白表達(dá)水平。 4新生大鼠隨機(jī)分為正�？諝饨M，高氧組和高氧+CGRP組。氧氣干預(yù)：空氣組處理吸入正常室內(nèi)空氣，高氧組和高氧+CGRP組給以氧體積分?jǐn)?shù)大于95%的氧氣吸入。CGRP干預(yù)：空氣組和高氧組腹腔注射生理鹽水，高氧+CGRP組給以αCGRP腹腔注射。共持續(xù)14d后，取肺組織做HE染色，試劑盒檢測肺內(nèi)MDA， SOD。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6），內(nèi)源性CGRP mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF-β1）蛋白表達(dá)通過Western blot檢測。 5通過持續(xù)吸入高濃度氧氣，建立新生大鼠高氧肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)組吸入氧體積分?jǐn)?shù)大于95%的醫(yī)用氧氣，對照組吸入空氣。分別留取第3d、7d和14d的肺組織，切片HE染色觀察肺臟病理改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)檢測肺組織Smo和Gli1蛋白的動態(tài)表達(dá)情況。 結(jié)果 1原代培養(yǎng)的AECⅡ產(chǎn)量較好，每只早產(chǎn)大鼠肺組織可獲得(8.1±1.1)×106AECⅡ，細(xì)胞活力為(95.5±1.6)％；細(xì)胞純度鑒定為（95.6±2.1）％。電鏡可見細(xì)胞膜表面特征微絨毛樣結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)可見板層小體。AECⅡ體外培養(yǎng)12h左右開始貼壁，至18h已絕大部分貼壁伸展，，至24h～48h生長良好，增殖活躍，密度適中，達(dá)最佳狀態(tài)，72h后細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)差，開始死亡。 2與空氣組比較，高氧暴露24h AECⅡ凋亡率明顯增加，ROS和MDA顯著升高，SOD活性明顯下降，SPC mRNA蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）； CGRP干預(yù)后可明顯降低AECⅡ凋亡率，下調(diào)ROS和MDA，上調(diào)SOD，促進(jìn)SPC mRNA表達(dá)（P＜0.05）。CGRP8-37能阻斷CGRP的生物學(xué)作用。 3與空氣組比較，高氧暴露24h AECⅡ Smo和Gli1基因和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）； CGRP干預(yù)后可明顯促進(jìn)Smo和Gli1基因和蛋白表達(dá)（P＜0.05）。CGRP8-37阻斷CGRP的生物學(xué)作用后，使Smo和Gli1的基因和蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。 4高氧誘導(dǎo)新生大鼠14d后肺組織呈現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎癥性病理改變。肺組織MDA增加，SOD減少，TNF-α和IL-6的表達(dá)升高。CGRP處理能緩解高氧對肺組織的損傷作用，能顯著改善組織病理學(xué)特征，抑制MDA的激活，促進(jìn)SOD激活，減少TNF-α的mRNA表達(dá)并抑制TGF-β1的產(chǎn)生。內(nèi)源性CGRP的mRNA表達(dá)各組之間未見差異。 5高氧暴露3d肺毛細(xì)血管開始充血，滲出；7d表現(xiàn)為肺結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤；14d肺泡融合，纖維增生，間隔增寬。高氧組Smo和Gli1蛋白主要分布于支氣管上皮，肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及部分纖維組織。和對照組相比，隨著高氧暴露時(shí)間的延長，Smo于高氧第7d表達(dá)顯著增加，14d達(dá)高峰；Gli1蛋白表達(dá)于14d顯著增加。 結(jié)論 1采用差速貼壁和差速離心法分離純化的AECⅡ數(shù)量大，純度高，活力好，可用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。對其中重要環(huán)節(jié)的重視和改進(jìn)可進(jìn)一步提高細(xì)胞數(shù)量、成活率和純度。 2氧體積分?jǐn)?shù)大于95%的氧氣濃度可顯著抑制AECⅡ增殖，并導(dǎo)致AECⅡ損傷，CGRP能部分對抗氧化應(yīng)激并促進(jìn)AECⅡ增殖。 3高氧誘導(dǎo)AECⅡ損傷的過程中有Shh信號通路的變化，CGRP部分對抗氧化應(yīng)激并促進(jìn)AECⅡ增殖的作用可能與Shh信號通路的激活有關(guān)。 4高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷與氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)相關(guān)，CGRP能部分緩解高氧誘導(dǎo)的肺損傷并對部分炎癥因子有調(diào)節(jié)作用。 5高濃度氧可致新生大鼠泡結(jié)構(gòu)紊亂和肺發(fā)育停滯，Smo和Gli1蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，這可能和高氧誘導(dǎo)的肺損傷和支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
[Abstract]:Background

Abstract : Continuous oxygen therapy with higher concentration and longer duration can lead to acute lung injury ( ALI ) or bronchogenic dysplasia ( bpd ) , which is a serious threat to the health of newborns .

Purpose

1 . Establish an AEC 鈪

本文編號：2037836