本文選題：幽門螺桿菌 + 多位點(diǎn)序列分析�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種螺旋狀、微需氧的革蘭陰性桿菌,屬于螺桿菌屬,定植于人胃黏膜表面。人類是其唯一的天然宿主,現(xiàn)已證實(shí)其感染與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關(guān)。幽門螺桿菌的致病性主要與細(xì)菌的毒力因子和機(jī)體的遺傳易感性兩者密切相關(guān)。人類對(duì)H.pylori普遍易感,但不同個(gè)體感染后的癥狀輕重各不相同,表現(xiàn)出明顯的致病性差異,輕者可長(zhǎng)期無癥狀攜帶,重者可發(fā)展為慢性胃炎、潰瘍甚至胃部腫瘤。其原因與菌株型別的毒力強(qiáng)弱相關(guān),和宿主的遺傳易感性也有緊密的相關(guān)性,從而導(dǎo)致了H.pylori的感染致病存在人種、地域、環(huán)境衛(wèi)生、營(yíng)養(yǎng)等顯著差異性。 H.pylori和人類的共同進(jìn)化至少可以追溯到人類剛走出非洲時(shí)的58000年前;H.pylori在與人類宿主的長(zhǎng)期共存中,其基因組也經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化選擇,細(xì)菌在進(jìn)化的過程中通過自然突變、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等方式發(fā)生遺傳物質(zhì)的改變,而引起性狀(定植能力、毒力、耐藥性等)的改變,因此從分子水平對(duì)H.pylori菌株的流行病學(xué)和菌株多態(tài)性進(jìn)行研究,觀察其分子變異與菌群表型的關(guān)系,有助于我們確定不同地區(qū)感染H.pylori的主要菌型,了解其遺傳背景和可能的來源,使得流行病學(xué)研究可以從表型特征的鑒別深入到基因特征的鑒定,探索基因在核酸水平的變化過程。 本文主要對(duì)H.pylori公認(rèn)的5個(gè)毒力相關(guān)因子的多態(tài)性及其在不同地域和疾病來源菌群中的分布進(jìn)行了分析,包括cagA,vacA,babA,dupA和iceA。同時(shí)從管家基因的角度,應(yīng)用MLST系統(tǒng)對(duì)不同來源的H.pylori菌株進(jìn)行基因水平的分型。此外,通過穩(wěn)定的H.pylori沙鼠定植模型,對(duì)H.pylori菌株的適應(yīng)性定植的微進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行了初步的探討,以期能為H.pylori的適應(yīng)性定植的生理學(xué)變化和定植機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供理論依據(jù),從而為進(jìn)一步研究H.pylori的致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。 主要完成了以下工作: 1. H.pylori相關(guān)毒力因子的多態(tài)性分析: 對(duì)122株H.pylori菌株(慢性胃炎患者47例,十二指腸潰瘍15株,胃潰瘍25例,萎縮性胃炎19株和胃癌15株;并包括了漢族、蒙族和藏族等5個(gè)不同的族群),基因組的vacA、CagA-EPIYA、iceA、dupA和定植因子babA進(jìn)行了特異引物PCR檢測(cè)和分析,結(jié)果:babA2基因的總陽性率為83.7%。icecA1基因型的總陽性率73.9%,dupA的總陽性率為40.5%。vacA基因,信號(hào)區(qū)s檢出vacA s1a陽性119株(97.5%)、s1b陽性3株(2.5%),s1c陽性108株(88.5%);而middle region的2種基因型檢出率差異不大,m1型在胃癌的所占比例較高,占73.3%。對(duì)CagA羧基端可變區(qū)氨基酸序列的分型,66.3%的菌株序列為含有3個(gè)EPIYA基序,其中主要以東亞型(East Asian type)為主,占89.5%(85/95)。 本研究中,中國(guó)H.pylori菌株70%均表現(xiàn)為vacA s1a/s1c +、babA2+、iceA1+、CagA-ABD型。不同分離來源菌株的主要CagA type序列型有所差異:在西藏,含4個(gè)(包括5個(gè))和以上EPIYA基序的菌株占了西藏分離株的66.7%(30/45),同時(shí)這類序列型也只出現(xiàn)在西藏分離株中;而來源于蒙族的H.pylori有60%為CagA-西方型菌株。90.5%的藏族來源菌株均含有4個(gè)或以上EPIYA基序,這可能是藏族H.pylori菌株的一個(gè)特征標(biāo)志,而這一特征性的CagA-EPIYA序列型,可能是西藏地區(qū),特別是藏族人群高H.pylori感染率和胃癌發(fā)病率發(fā)生的基礎(chǔ)。因此,H.pylori菌株在不同地域有其主要分布的基因型。 2.毒力相關(guān)因子間的關(guān)系: 76.8%的m1型菌株帶有iceA1基因型,除西藏外的其他分離地點(diǎn),m1型H.pylori菌株均為iceA1型;而基因型iceA2菌株除西藏分離株外,均為vacA m2型陽性�？梢奿ceA1型與vacA m1型也有一定的相關(guān)性,但是這種協(xié)同作用需要考慮到地區(qū)差異性,如在西藏分離菌株的iceA2檢出率明顯高于其他地點(diǎn)。 對(duì)于CagA分型為西方型的菌株,90%為vacA m2,50%帶有babA2和iceA2基因;可見毒力較弱的西方型菌株,大多攜帶vacA m2和iceA2基因,而且babA2型的檢出率也較低。而含有4個(gè)和4個(gè)以上EPIYA基序的菌株,96.7%帶有vacA m1和babA2,70%表現(xiàn)為iceA1型。而東亞型ABD中,54%的菌株為m1型,在含有4個(gè)和以上EPIYA基序的菌株中只有3.6%的表現(xiàn)為m2型。這也證實(shí)了在毒力因子之間的存在一定的關(guān)聯(lián)性。 3. MLST分析: PCR測(cè)定分析了atpA,efp,mutY,ppa,trpC,ureI和yphC,7個(gè)管家基因的目的核酸片段。使用BURST程序可根據(jù)等位基因圖譜將菌株所分為3組,其余STs序列型屬于獨(dú)特型(singletons)。對(duì)于西藏分離株來說,此群的核心菌株可能是ST2237;而在內(nèi)蒙古地區(qū),菌株與標(biāo)準(zhǔn)株與國(guó)外來源的西方菌株的聯(lián)系更為明顯。 4. H.pylori適應(yīng)株的SNP分析和鑒定: 從穩(wěn)定的H.pylori定植沙鼠模型中分離得到不同定植時(shí)期的H.pylori菌株,通過全基因組測(cè)序,采用SOAPsnp方法分析初步篩選出了適應(yīng)株的61個(gè)與定植相關(guān)SNPs位點(diǎn),且主要分布在10個(gè)基因位點(diǎn)中。通過PCR和測(cè)序方法進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),其中的SNPA變異所在的黏附素AlpB蛋白的Asn130-Gly150結(jié)構(gòu)域與H.pylori適應(yīng)性定植密切相關(guān)。對(duì)此位點(diǎn)進(jìn)行了聚類分析發(fā)現(xiàn),不同來源的30株H.pylori可以被分為2群。該位點(diǎn)不僅在適應(yīng)株中發(fā)生了較大的變異,在臨床菌株中也存在明顯的多態(tài)性。這可能是因?yàn)榫甓ㄖ灿诓煌拗?為了適應(yīng)不同的胃部微環(huán)境,AlpB發(fā)生了不同的變異,形成了這段結(jié)構(gòu)域的多態(tài)性;這可能會(huì)是H.pylori菌株一個(gè)新的分型位點(diǎn)。 結(jié)論: 本研究針對(duì)H.pylori基因組的5種主要的毒力因子,對(duì)中國(guó)不同來源菌株進(jìn)行了多態(tài)性的分析,中國(guó)H.pylori菌株的基因型主要為:vacA s1a/s1c/m2 +;babA2+;iceA1+;CagA-ABD型。西藏分離株菌型特點(diǎn)為:cagA 3’端可變區(qū)的氨基酸序列主要含有4個(gè)或4個(gè)以上EPIYA基序;而藏族H.pylori菌株vacA s1a/s1c/m1陽性率均高于中國(guó)其他地區(qū)。蒙族H.pylori菌株,出現(xiàn)m2型,dupA+,和CagA-西方型的幾率高于其他族群,提示這群H.pylori可能和藏族菌株有著相反的疾病發(fā)展譜。MLST分析菌株結(jié)果均為新的序列型,反映了細(xì)菌高度的多態(tài)性;系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)現(xiàn)蒙族菌株與西方型H.pylori菌株有著遺傳相關(guān)性。對(duì)H.pylori適應(yīng)性定植的微進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)黏附素AlpB蛋白的Asn130-Gly150結(jié)構(gòu)域與H.pylori適應(yīng)性定植密切相關(guān);不同來源的人源性H.pylori菌株基因組在Asn130-Gly150結(jié)構(gòu)域也有不同程度的變異,可能與不同菌株的適應(yīng)性定植能力的差異有關(guān)。 上述研究工作為建立我國(guó)H.pylori菌株基因信息庫(kù)提供了數(shù)據(jù),同時(shí)為研究中國(guó)特征性H.pylori菌群的分子進(jìn)化和流行規(guī)律、篩選與相關(guān)表型聯(lián)系的靶基因位點(diǎn)提供了有利的線索和依據(jù),為下一步建立進(jìn)化模型,研究適應(yīng)性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Helicobacter pylori ( H . pylori ) is a kind of spiral , micro - aerobic gram - negative bacillus , belongs to the genus Helicobacter , and is implanted on the surface of human gastric mucosa . Human is the only natural host . The pathogenicity of H . pylori is mainly related to the virulence factor of bacteria and the genetic susceptibility of organism .

H . pylori ( H . pylori ) and human co - evolution can be traced back to 58000 years ago when humans have just walked out of Africa .

In this paper , we analyzed the polymorphism of five virulence - related factors and the distribution of H . pylori strains in different regions and diseases from the perspective of housekeeping gene .

The following tasks have been completed :

1 . Analysis of polymorphism of H.pylori - associated virulence factors :

Among 122 strains of H . pylori ( 47 cases of chronic gastritis , 15 strains of duodenal ulcer , 25 cases of gastric ulcer , 19 of atrophic gastritis and 15 gastric cancer , respectively ) , the total positive rate of the gene was 83.7 % .

In the present study , 70 % of H . pylori strains in China were expressed as vacA s1a / s1c + , babA2 + , iceA1 + , A - ABD .

2 . Relationship between virulence - related factors :

76.8 % of the m1 - type strains had iceA1 genotype , except for the other isolates except Tibet , the type m1 H.pylori was the iceA1 type , while the genotype iceA2 was positive for vacA m2 except for the Tibetan isolates . The type of iceA1 was also correlated with vacA m1 type . However , this synergistic effect would need to take into account the regional difference , such as the detection rate of iceA2 in isolated strains in Tibet was significantly higher than that of other sites .

In East Asia type ABD , 54 % of the strains were m1 type , only 3.6 % of the strains with 4 and more EPIYA motifs were m2 type . This also confirmed the existence of association between virulence factors .

3.MLST Analysis :

The target nucleic acid fragment of atpA , efp , mutY , ppa , trPC , ureI and yphC , 7 housekeeping genes was determined by PCR assay .

4 . SNP analysis and identification of H . pylori strains :

It was found that the Asn130 - Gly150 domain of the adhesin of different sources was closely related to the adaptive colonization of H.pylori by sequencing . The results showed that the Asn130 - Gly150 domain of the adhesin of different sources was closely related to H . pylori .

Conclusion :

The results showed that the positive rates of vacA s1a / s1c / m1 were significantly higher than those in other regions of China .

In order to study the molecular evolution and epidemic rules of H . pylori strains in China , the research work provides an advantageous clue and basis for studying the molecular evolution and epidemic rules of H . pylori strains in China , and lays a foundation for the next step of establishing an evolutionary model and studying the adaptability mechanism .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2033222