本文選題：膿腫分枝桿菌 + 磷脂酶C��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的 克隆、表達膿腫分枝桿菌磷脂酶C基因，鑒定其活性，為進一步探討該蛋白質的生物學功能及其在膿腫分枝桿菌感染過程中的致病作用提供實驗材料。 方法 以膿腫分枝桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增膿腫分枝桿菌磷脂酶C基因片段，克隆入pQE-30質粒，構建重組原核表達載體pQE-30-MAB_0555，將其轉化入大腸桿菌DH5a，進行序列測定及利用生物信息學軟件DNAstar5.0等分析其生物學特性，同時IPTG誘導蛋白表達，采用SDS-PAGE分析表達蛋白的相對分子質量，應用Western-blotting檢測蛋白表達，離子交換層析純化重組蛋白，杯碟法檢測其活性。 結果 PCR擴增獲得長1440bp的MAB_0555基因片段，編碼479個氨基酸，經(jīng)PCR、雙酶切及測序證明重組質粒pQE-30-MAB_0555構建正確。DNAstar等軟件預測其蛋白質相對分子量（Mr）約為53KD,并顯示出具有良好的抗原性。SDS-PAGE顯示表達蛋白相對分子量約為53KD，同生物信息學分析軟件所得的估計值一致；Western-blotting檢測蛋白得到表達，杯碟法觀察到在瓊脂卵黃平板上可見乳白色暈圈，而血平板上未見溶血環(huán)。 結論 成功的克隆了膿腫分枝桿菌磷脂酶C基因和構建重組質粒pQE-30-MAB_0555，應用生物信息學方法分析出該蛋白具有良好的抗原性；同時應用Western-blotting技術分析重組蛋白得到正確表達，，并通過卵黃瓊脂平板法證實重組蛋白具有溶解蛋黃中卵磷脂的作用，通過血平板法證實重組蛋白不具有溶解紅細胞膜的作用。為進一步探討該蛋白質的生物學功能及其在膿腫分枝桿菌感染過程中的致病作用提供實驗材料。
[Abstract]:Objective to clone, express and identify the phospholipase C gene of Mycobacterium abscess. In order to further study the biological function of the protein and its pathogenicity in the process of infection of Mycobacterium abscess, the genomic DNA of Mycobacterium abscess was used as template to amplify the fragment of phospholipase C gene of Mycobacterium abscess by PCR. The recombinant prokaryotic expression vector pQE-30-MAB0555 was cloned into pQE-30 plasmid, and transformed into Escherichia coli DH 5a. Its biological characteristics were analyzed by bioinformatics software DNAstar5.0, and the expression of protein was induced by IPTG. SDS-PAGE was used to analyze the relative molecular weight of the expressed protein, Western-blotting was used to detect the protein expression, ion exchange chromatography was used to purify the recombinant protein, and its activity was detected by cup / disc method. PCR, double enzyme digestion and sequencing proved that the recombinant plasmid pQE-30-MAB0555 was constructed correctly. DNAstar and other software predicted that the relative molecular weight of the protein was about 53KD.SDS-PAGE showed good antigenicity. SDS-PAGE showed that the relative molecular weight of the expressed protein was about 53KDand the same biological information. The estimated value of the software was consistent with that of Western-blotting for protein expression. The cream white halo circle was observed on the Agar yolk plate by the cup plate method. Conclusion the phospholipase C gene of Mycobacterium abscess was cloned and the recombinant plasmid pQE-30-MAB0555 was constructed. At the same time, Western-blotting technique was used to analyze the correct expression of recombinant protein. The recombinant protein was proved to be able to dissolve lecithin in egg yolk by using egg yolk Agar plate method, and the recombinant protein was not able to dissolve erythrocyte membrane by blood plate method. To further study the biological function of the protein and its pathogenicity in the process of mycobacterium abscess infection.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378

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本文編號：2006794