本文選題：臍帶 + 間充質(zhì)干細胞�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2012年碩士論文

【摘要】：間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是一群具備自我更新及多向分化潛能的成體干細胞。在特定的條件下能夠向骨、軟骨、脂肪、肌肉等細胞分化[1-3]。MSC最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)但骨髓來源的MSC存在病毒污染、細胞含量少、以及年齡導(dǎo)致的擴增和分化能力下降[4]。近年來，，許多學(xué)者在脂肪、肌肉、胎盤、肺臟、羊水、臍血、胎肝、胎肺等組織和器官中均分離出MSC[5,6]。MSC最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，但骨髓中含量極少，且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能，并且隨著年齡的增長其細胞數(shù)量和擴增分化能力亦顯著降低。近年來，國內(nèi)外大量研究證明臍帶作為胎兒發(fā)育的一部分，含有大量的多能干細胞，細胞生長擴增速度快，且臍帶屬于胚胎外組織，在胎兒娩出后成為“廢棄物”，取材方便，來源豐富，無倫理學(xué)問題，因此，被看作是骨髓間充質(zhì)干細胞的主要替代品，具有巨大的臨床應(yīng)用價值[7,8]。造血干細胞移植是臨床治愈一些血液疾�。ò籽。偕系K性貧血，多發(fā)性骨髓瘤，免疫缺陷病，極重度放射病等）的唯一有效的解決方法。近年來，間充質(zhì)干細胞由于其低免疫原性，多向分化能力，造血支持作用被作為種子細胞應(yīng)用于多個臨床系統(tǒng)疾病，臨床上主要用于治療機體無法自然修復(fù)的組織細胞和器官損傷等多種難治性疾病，如移植物抗宿主病(GVHD)、心肌梗死、骨損傷、皮膚損傷修復(fù)、脊髓損傷、腦癱、肌萎縮側(cè)索硬化癥、中風(fēng)等；作為免疫調(diào)節(jié)和造血支持細胞，用于治療免疫排斥和自身免疫性疾病，如成骨不全綜合癥系等。間充質(zhì)干細胞具有體外促進造血的功能，將間充質(zhì)干細胞與造血干細胞共移植將促進造血干細胞的增殖，從而加大移植的治療效果[8,9]。但是，間充質(zhì)干細胞發(fā)揮其作用的分子機制尚不清楚。因此，本研究的主要目的是探討臍帶間充質(zhì)干細胞的造血支持功能及其相關(guān)分子機制。 Notch信號通路(Notch signaling pathway)是調(diào)節(jié)造血干細胞分化與微環(huán)境作用的經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其經(jīng)典的功能為調(diào)節(jié)干主細胞的分化，細胞凋亡及細胞增殖，Noch信號分子為為一類高度保守的跨膜蛋白類，受體及配體均由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)三部分組成。Notch信號分子受體包括(Notch1-4)，配體包括(Jagged1、Jagged2、Delta1、3、4)[19,20]。受體、配體結(jié)合后釋放胞內(nèi)段蛋白(NICD),胞內(nèi)段蛋白進入細胞核內(nèi)激活下游靶基因Hes家族。Notch受體及配體對于維持造血干細胞的未分化狀態(tài)極其重要，在造血系統(tǒng)中造血干細胞表面表達大量的Notch受體，而基質(zhì)細胞表面表達大量的Notch配體。受體、配體的正常表達維持著造血干細胞系統(tǒng)的正常狀態(tài)，當(dāng)異常時將導(dǎo)致惡性增殖性疾病的發(fā)生。多年來，我們熟知間充質(zhì)干細胞可以通過分泌大量的細胞因子等間接的方式來調(diào)節(jié)造血干細胞的分化及增殖，但其也可通過直接的接觸方式來調(diào)節(jié)造血干細胞的增殖，體內(nèi)造血干細胞表面主要表達Notch受體而基質(zhì)細胞表面主要表達Notch配體，間充質(zhì)干細胞作為體內(nèi)基質(zhì)細胞的前體細胞，理論上具備通過Notch信號通路調(diào)節(jié)造血干細胞的潛質(zhì)[22,23,24]。 首先，我們通過機械分離及膠原酶消化法從臍帶中獲取組織細胞，通過反復(fù)純化獲得UC-MSC；然后通過細胞形態(tài)、細胞生長曲線、細胞周期、多向分化潛能及免疫表型五個方面進行比較和鑒定。結(jié)果表明：臍帶MSC(umbilical cordmesenchymal stem cell, UC-MSC)具備骨髓MSC的生物學(xué)特性：1)細胞形態(tài)：培養(yǎng)至第三代細胞形態(tài)較均一，呈典型的成纖維樣，平行或漩渦裝排列，貼壁生長；2)多向分化潛能：細胞可向成脂，成骨，成軟骨等方向分化；3)免疫表型：流式細胞儀檢測細胞免疫表型結(jié)果顯示：臍帶不同組織來源的MSC同BM-MSC類似，均表達間充質(zhì)干細胞特異性抗原CD73、CD90、CD105，低表達或不表達造血及內(nèi)皮細胞表面標志即CD14、CD31、CD34、CD45，以及移植免疫排斥相關(guān)的表面標志HLA-DR；4)均有80％以上的細胞處于G0/G1，提示臍帶不同來源的MSC同BM-MSC一樣均具有典型的干細胞增殖特點，即只有少數(shù)細胞處于活躍的增殖期；5)連續(xù)將間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)8天發(fā)現(xiàn)在2-7天間充質(zhì)干細胞處于指數(shù)生長期； 其次，建立臍帶間充質(zhì)干細胞和造血干細胞的體外共培養(yǎng)體系，應(yīng)用相對定量分析法，通過Real time PCR分析Notch信號分子在培養(yǎng)前后表達的改變，將標本中的β-actin基因作為參照基因、共培養(yǎng)前的數(shù)據(jù)作為校準樣本、共培養(yǎng)后的數(shù)據(jù)作為待測樣本比較待測樣本相對于校準樣本的表達差異。進而在培養(yǎng)體系中加入信號傳導(dǎo)阻滯劑DAPT比較下游靶基因Hes-1基因活化狀態(tài)的改變。結(jié)果表明：Notch配體及受體在臍帶MSC及臍血CD34+細胞表面均有表達，且共培養(yǎng)前后存在配體Jagged1及受體Notch1表達的明顯改變，同時下游靶基因Hes-1表達明顯增加。而在培養(yǎng)體系中加入DAPT后Real time PCR檢測Hes-1基因相對于CD34+細胞單獨培養(yǎng)表達未出現(xiàn)改變，而Western-blot檢測也未見Notch受體胞內(nèi)段(NICD)的表達。 綜上所述，本研究建立了一種從成熟臍帶中分離間充質(zhì)干細胞的方法，發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出良好的造血支持功能，而Notch信號通路在這種功能發(fā)揮過程中起著至關(guān)重要的作用。本研究為組織工程、基因治療和細胞治療提供了更廣闊的MSC細胞來源，為MSC更好地應(yīng)用于臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells ( MSCs ) are a group of adult stem cells with self - renewal and multi - directional differentiation potential . In recent years , many scholars have isolated MSCs from the tissues and organs such as fat , muscle , placenta , lung , amniotic fluid , cord blood , fetal liver , fetal lung , etc .
The mesenchymal stem cells are used for the treatment of immune rejection and autoimmune diseases , such as osteogenic syndrome , etc . The mesenchymal stem cells have the functions of promoting the hematopoietic function in vitro , and the mesenchymal stem cells and the hematopoietic stem cell co - transplantation will promote the proliferation of hematopoietic stem cells , thus increasing the therapeutic effect of the transplantation .

Notch signaling pathway is a classical signal transduction pathway for regulating differentiation and microenvironment of hematopoietic stem cells . The classical function of Notch signaling pathway is to regulate differentiation , apoptosis and cell proliferation of hematopoietic stem cells .

Firstly , the tissue cells were obtained from the umbilical cord by mechanical separation and collagenase digestion , and UC - MSC was obtained by repeated purification .
The results showed that umbilical cordmesenchymal stem cell ( UC - MSC ) had the biological characteristics of bone marrow MSC : 1 ) cell morphology : the third generation cell morphology was homogeneous , which was typical fibroblast - like , parallel or vortex - mounted arrangement , adherent growth ;
2 ) multi - directional differentiation potential : the cells can be differentiated into lipid , osteogenic , chondrogenic , and the like ;
3 ) Immunophenotypic analysis : The results showed that the expression of CD73 , CD90 , CD105 , low expression or non - expression of CD73 , CD90 , CD105 , low expression or non - expression of hematopoietic and endothelial cell surface markers , such as CD14 , CD31 , CD34 , CD45 and HLA - DR related to immune rejection , were similar to BM - MSC .
4 ) There were more than 80 % of the cells in G0 / G1 , suggesting that MSCs from different origins of the umbilical cord had the typical characteristic of stem cell proliferation as BM - MSC , that is , only a few cells were in an active proliferative phase ;
5 ) continuously culturing mesenchymal stem cells for 8 days , and finding that the mesenchymal stem cells are in an exponential growth period for 2 - 7 days ;


In this paper , the expression of 尾 - actin gene in human umbilical cord MSC and cord blood CD34 + cells was analyzed by Real time PCR .

In conclusion , this study has established a method of separating mesenchymal stem cells from mature umbilical cord . It is found that umbilical cord mesenchymal stem cells play a very important role in vivo and in vivo , and Notch signaling pathway plays a crucial role in this function . This study provides a broader source of MSC cells for tissue engineering , gene therapy and cell therapy , which lays a theoretical foundation for the better application of MSC to clinical treatment .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2003306