本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞 + 分離純化��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：病毒性肝炎是一種嚴重威脅人類健康的常見病,特別是乙型肝炎病毒(HBV)所引起的乙型病毒性肝炎,全球約有3億以上慢性病毒性肝炎及其病毒攜帶者,而我國是一個病毒性肝炎大國,約有1.2億慢性病毒性肝炎感染者。由于各種原因所引起的病毒反復(fù)活動破壞肝實質(zhì)細胞,可引起肝細胞的變性、壞死,纖維組織增生和肝細胞結(jié)節(jié)狀再生,從而進一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,已成為威脅肝病患者生命的主要原因。目前原位肝移植(OLT)是治療各種肝功能失代償期、肝功能衰竭期最有效的治療方法,但因為肝源缺乏、費用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了OLT的廣泛應(yīng)用。 近年來,新的干預(yù)性治療不斷出現(xiàn),通過進行干細胞移植,利用外源性的具有高度增殖活性和多向分化能力的干細胞移植來達到損傷組織或細胞的修復(fù)與再生的目的。間充質(zhì)來源的成體干細胞稱間充質(zhì)干細胞(MSC),其概念最初是由Friedenstein和同事于20世紀70年代提出的.Friedenstein和同事在培養(yǎng)骨髓細胞時發(fā)現(xiàn)一種與成纖維細胞形態(tài)相似,貼壁生長的梭形細胞,有集落形成能力,在體內(nèi)和體外均可分化為成骨細胞、成軟骨細胞與基質(zhì)細胞。目前證實間充質(zhì)干細胞存在于機體的多種組織中,包括臍帶、臍帶血、骨髓、脂肪、外周血、骨骼肌等。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是指來源于骨髓的間充質(zhì)干細胞,是間充質(zhì)干細胞所有種類中來源最豐富和應(yīng)用最廣泛的一種細胞。體外大量研究證實了骨髓間充質(zhì)干細胞有著高度的自我更新能力和較強的多胚層分化潛能,在特定因素誘導(dǎo)下可以分化為骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞和肝細胞。 大量動物實驗及臨床研究表明,骨髓來源間充質(zhì)干細胞移植用于治療肝臟相關(guān)性疾病中可獲得以下效果：先天性肝臟代謝缺陷疾病的糾正,可改善肝性腦病癥狀,暫時性替代部分肝細胞和肝臟組織的功能,提高血清白蛋白水平,降低血清轉(zhuǎn)氨酶、血氨及總膽紅素水平。隨著干細胞研究的深入,BMSCs移植在不久的將來會成為臨床肝臟疾病治療的常規(guī)手段。 目的： 1、探索體外分離純化、凍存大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的最適方法,探討體外培養(yǎng)BMSCs是否具有成瘤性,為其成為組織工程與臨床康復(fù)理想的種子細胞提供實驗依據(jù)。 2、探索不同途徑移植GFP標記的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在慢性肝纖維化的作用,以及移植后細胞在肝臟組織內(nèi)存活、分布情況,為臨床BMSCs應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1、購清潔級別SD雄性大鼠,6只,1月齡,利用沖洗骨髓腔的方法所獲得大鼠BMSCs,加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,吹打混勻后給予相應(yīng)的處理。A組給予1.5h棄貼壁細胞,24h首次換液后繼續(xù)培養(yǎng)；B組24h首次換液后繼續(xù)培養(yǎng)；C組48h首次換液后培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞貼壁情況及形態(tài)學(xué)變化。 2、待P3細胞長至80%一85%匯合,消化細胞后向沉淀物中加入血清濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%的細胞冷凍液,輕輕吹打混勻,使細胞密度達1×106個/mL后置于梯度凍存盒,-80℃冰箱短期保存。1月后行凍存細胞復(fù)蘇。輕輕吹吸混勻后分為三組,A組細胞復(fù)蘇后行臺盼藍染色,計算細胞存活率；B組細胞懸液接種到96孔板培養(yǎng),分別在接種后第1到8天每天取3個孔,行活細胞計數(shù)后繪制出細胞生長曲線；C組成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)D21天后行油紅O染色,觀察復(fù)蘇后細胞成脂能力。 3、購SPF級裸鼠,6只,1月齡,實驗組將P3、P15代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞行免疫組織化學(xué)染色和成脂誘導(dǎo)鑒定后,分別通過裸鼠后肢股四頭肌肌肉、肝臟組織局部注射體內(nèi)移植,對照組以生理鹽水局部注射至相應(yīng)部位。觀察裸鼠生存狀態(tài)及接種部位有無新生物形成,45天后行注射部位病理組織標本HE染色檢查觀察有無異型細胞生長。 4、購清潔級SD雄性大鼠,15只,300±50g,將苯巴比妥鈉注射液350mg/L混于純水中供大鼠飲用,7天后按每100g0.125ml/四氯化碳橄欖油混合液(2：3)給予大鼠灌胃,2次／周,持續(xù)8周。8周后將存活下來的肝硬化模型大鼠行肝功能檢測,根據(jù)檢測結(jié)果將成功造模的肝硬化大鼠隨機分為尾靜脈移植組、肝臟局部注射組、肝動脈注射組、肝門靜脈注射組和肝硬化未移植組。 5、購清潔級SD雄性大鼠,2只,1月齡,利用全骨髓差速貼壁法分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞,一部分用于CD34、CD44免疫組織化學(xué)染色和成脂誘導(dǎo)鑒定,一部分利用攜帶EGFP基因的慢病毒載體感染標記骨髓間充質(zhì)干細胞。 6、通過尾靜脈、肝臟局部注射、肝動脈注射、肝門靜脈四種注射途徑將標記好的BMSCs移植到肝硬化模型大鼠體內(nèi),移植后維持四氯化碳肝損傷,1月后處死大鼠檢測血清白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶指標；取肝臟組織行HE染色和天狼星紅-苦味酸染色觀察肝硬化程度；取肝臟組織白片在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。 結(jié)果 1、A組可見大量骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁生長,多為短梭形和不規(guī)則三角形,核橢圓形,較大,有的可見雙核,B組、C組除了可見短梭形細胞外,還可見較大的圓形細胞及長梭形細胞貼壁,細胞組成形態(tài)較A組復(fù)雜。 2、凍存與復(fù)蘇對骨髓間充質(zhì)干細胞的存活和增殖能力存在一定的影響,細胞生長潛伏期延長,隨著血清濃度的遞減這種影響也愈加明顯；接種密度偏高利于細胞復(fù)蘇后生長與增殖,含30%血清組接種密度過低,細胞生長速度較其他各組慢,但待細胞增殖到某一數(shù)量后細胞增殖速度明顯加快。 3、BMSCs傳至15代仍保持間充質(zhì)干細胞特性,BMSCs移植入裸鼠肝臟45天后可在局部肝臟存活,生長狀態(tài)與體外培養(yǎng)相似,無異型性及向周圍浸潤生長。 4、全骨髓差速貼壁法24h后給予全量換液去除未貼壁細胞后,可見散在貼壁細胞,形態(tài)較為均一,成短梭形或星形。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增長,逐漸出現(xiàn)放射狀排列的細胞集落。7-12天細胞增殖旺盛,集落逐漸融合,排列緊密并成旋渦狀。P3代細胞免疫組織化學(xué)染色CD34-,CD44+,成脂誘導(dǎo)油紅O染色(+),具有骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性。 5、肝功能檢測提示苯巴比妥聯(lián)合四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝纖維化損傷持續(xù)8周(移植前)各組白蛋白(Alb)水平均較正常大鼠低,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性均較正常大鼠高,移植后各組Alb持續(xù)性下降,谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平因肝損傷刺激的減少也逐漸下降,且各組下降幅度相當。 6、不同途徑大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植后肝臟組織病理組織切片HE染色示正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細胞排列紊亂,可見大量肝細胞空泡變性,門管區(qū)有廣泛的膠原纖維增生,向小葉內(nèi)伸展,形成假小葉。天狼猩紅-苦味酸染色示骨髓間充質(zhì)干細胞移植組和對照生理鹽水注射組在肝門靜脈區(qū)和肝實質(zhì)內(nèi)均有大量紅染膠原纖維沉積,形成假小葉。 7、經(jīng)GFP標記的骨髓間充質(zhì)干細胞與P3代骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)類似,隨著體外培養(yǎng)時間的延長,細胞的綠色熒光逐漸減退,變成黃綠色甚至黃色。移植后四周肝臟局部組織切片免疫熒光顯微鏡下觀察示：尾靜脈移植組在門管區(qū)纖維間隔內(nèi)可見大量表達黃色熒光信號的細胞,局部注射組、肝動脈組、門靜脈組亦分別在局部注射部位、小葉間動脈、小葉間靜脈(中央靜脈)等部位見到黃色熒光表達,且均分布在膠原纖維含量較多的部位。 結(jié)論： 1、本實驗首次利用1.5h差速貼壁結(jié)合24h首次全量換液法,在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的BMSCs,且具有操作簡單、快捷、實用、對細胞損傷小等優(yōu)點,為其作為組織工程種子細胞提供了實驗基礎(chǔ)。 2、含30%濃度的血清凍存液凍存骨髓間充質(zhì)干細胞,既可最大化的保證骨髓間充質(zhì)干細胞活性及增殖能力,又可保證其遺傳特性和多分化的能力。 3、體外長時間培養(yǎng)BMSCs在15代以內(nèi)移植入裸鼠體內(nèi)可以在局部肝臟內(nèi)存活,且沒有成瘤性,隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增多其具有成瘤性的風(fēng)險增加。 4、免疫熒光顯微鏡下觀察表達熒光信號的細胞在肝小葉內(nèi)的分布不同,考慮可能與細胞移植途徑有關(guān),但均分布在肝小葉匯管區(qū)或小葉血管周圍膠原纖維沉積較多的部位。 5、各組肝功能檢測、HE染色及膠原纖維染色結(jié)果提示單純進行BMSCs移植各組的肝功能均未得到明顯的改善,而肝纖維化程度也沒有得到減輕,甚至表現(xiàn)為更進一步的加重 6、.臨床上通過介入手段經(jīng)肝動脈移植BMSCs已成為常見治療手段,在移植同時可進行肝動脈造影,進行鑒別診斷,分區(qū)栓塞化療等可以作為首選移植方法。但經(jīng)外周靜脈移植操作簡單,創(chuàng)傷少,死亡率低,可作為動物實驗體內(nèi)移植首選方法
[Abstract]:Viral hepatitis is a common disease which is a serious threat to human health, especially the hepatitis B virus (HBV) caused by hepatitis B virus (HBV). There are more than 300 million chronic viral hepatitis and virus carriers in the world, and China is a big country with viral hepatitis. There are about 120 million chronic viral hepatitis infected people. The repeated activity of the virus destroys the liver parenchyma, causes degeneration, necrosis, fibrous tissue proliferation and nodular regeneration of liver cells, and further develops into liver cirrhosis and even liver cancer, which has become the main cause of the life of patients with liver disease. At present, in situ liver transplantation (OLT) is the treatment of various liver function decompensation and liver function failure. The most effective treatment is exhaustion. However, because of the shortage of liver resources, high cost and complications after transplantation, OLT has been widely used.
In recent years, new intervention therapy has emerged. By stem cell transplantation, exogenous stem cells with highly proliferative and pluripotent differentiation are used to repair and regenerate tissue or cells. Mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells are called mesenchymal stem cells (MSC). The concept of mesenchymal stem cells is originally Frieden Stein and colleagues in 1970s,.Friedenstein and colleagues found a form of spindle cells similar to fibroblasts in the cultivation of bone marrow cells. They have colony-forming ability and can differentiate into osteoblasts, chondrocytes and stromal cells in vivo and in vitro. It is currently found that mesenchymal stem cells exist in the cells. Multiple tissues of the body include umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, peripheral blood, skeletal muscle, etc. bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) refer to mesenchymal stem cells derived from bone marrow, which are the most abundant and widely used cells in all kinds of mesenchymal stem cells. A large number of studies in vitro have confirmed that bone marrow mesenchymal stem cells have a large number of cells in vitro. With a high degree of self renewal and a strong multi germ layer differentiation potential, it can be differentiated into bone cells, chondrocytes, skeletal myocytes, adipocytes, endothelial cells, cardiomyocytes, astrocytes, astrocytes, and hepatocytes under specific factors.
A large number of animal experiments and clinical studies have shown that bone marrow derived mesenchymal stem cell transplantation can achieve the following effects in the treatment of liver related diseases: correction of congenital metabolic disorders of the liver can improve the symptoms of hepatic encephalopathy, temporarily replace the function of some liver cells and liver groups, improve serum albumin level, and reduce blood. With the development of stem cell research, BMSCs transplantation will become a routine treatment for clinical liver diseases in the near future.
Objective:
1, to explore the best method of isolation and purification of Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro, and to explore whether the in vitro culture of BMSCs has a tumorigenicity, and provides an experimental basis for it to become the ideal seed cell for tissue engineering and clinical rehabilitation.
2, to explore the role of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplanted with GFP markers in chronic hepatic fibrosis and the survival and distribution of cells in the liver after transplantation, providing a theoretical basis for clinical BMSCs application.
Method錛，

本文編號：2000829