本文選題：肺炎鏈球菌 + 蛋白質(zhì)��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：目的：肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是人類主要致病菌，在臨床上廣泛引起中耳炎、敗血癥、腦膜炎及致死性肺炎等多種疾病。全球每年大約有160萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌引起的各種疾患。盡管抗生素治療是控制肺炎鏈球菌感染的有效手段，但并不能有效降低肺炎鏈球菌感染最初48小時(shí)的死亡率。隨著抗生素的濫用，臨床上耐藥菌株明顯增加。因此，通過(guò)接種肺炎鏈球菌疫苗以預(yù)防其感染成為積極有效的手段。 新一代的蛋白疫苗是預(yù)防肺炎鏈球菌感染的未來(lái)發(fā)展方向，但目前國(guó)際上對(duì)蛋白質(zhì)疫苗尚處于臨床前研究階段，由于單一蛋白的保護(hù)效果并不理想，聯(lián)合蛋白疫苗是目前研究的熱點(diǎn)。采用多種肺炎鏈球菌毒力蛋白聯(lián)合免疫，以擴(kuò)大其對(duì)機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)是一種可行方式,因?yàn)榈鞍卓乖?lián)合疫苗提供了多種毒力作用的潛在靶標(biāo)。 Gts、PotD和SrtA蛋白都是肺炎鏈球菌的重要毒力因子，生物信息學(xué)分析顯示其在肺炎鏈球菌中保守性高，且均在細(xì)菌表面有表達(dá)，但尚未有報(bào)道對(duì)其作為疫苗候選蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。本研究擬先比較肺炎鏈球菌Gts、PotD和SrtA單個(gè)蛋白抗原免疫小鼠后，對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)作用；然后采用不同血清型的肺炎鏈球菌，檢測(cè)上述蛋白兩兩聯(lián)合、三種蛋白組合后免疫小鼠，與單個(gè)蛋白抗原組比較，以評(píng)價(jià)其對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果。 方法：本研究首先通過(guò)基因克隆、蛋白表達(dá)及純化技術(shù)，成功制備了肺炎鏈球菌Gts、PotD及SrtA重組蛋白。重組蛋白經(jīng)鼻腔免疫途徑，以研究抗原特異性反應(yīng)，并檢測(cè)其體液和細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)。為了模擬肺炎鏈球菌感染的自然途徑，以評(píng)價(jià)Gts、PotD及SrtA重組蛋白抗原對(duì)小鼠鼻腔感染后的保護(hù)效果，選擇肺炎鏈球菌中致病能力最強(qiáng)的D39菌株進(jìn)行鼻腔攻毒實(shí)驗(yàn)，以構(gòu)建肺炎鏈球菌性肺炎的小鼠模型。為了更充分地評(píng)估Gts、PotD和SrtA重組蛋白不同組合對(duì)多種血清型肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果，本研究采用上述重組蛋白抗原經(jīng)小鼠腹腔免疫，然后選擇不同血清型肺炎鏈球菌進(jìn)行腹腔攻毒實(shí)驗(yàn)研究。再次采用特異性抗血清免疫小鼠后，選擇D39肺炎鏈球菌進(jìn)行鼻腔攻毒實(shí)驗(yàn)，以鑒定重組蛋白抗原的保護(hù)性是否由其特異性抗體介導(dǎo)的。采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，以分析Gts、PotD和SrtA重組蛋白及其特異性抗血清對(duì)D39細(xì)胞粘附于A549細(xì)胞的影響；最后，為了進(jìn)一步探討人體經(jīng)肺炎鏈球菌感染后，該細(xì)菌表面抗原Gts、PotD和SrtA刺激機(jī)體產(chǎn)生的天然抗體滴度變化，本研究收集正常人群及急性肺炎患者，擬采用ELISA法測(cè)定血清中anti-Gts、anti-PotD及anti-SrtA抗血清的滴度變化。 結(jié)果：在成功克隆和表達(dá)Gts、PotD和SrtA重組蛋白基礎(chǔ)上，通過(guò)Western blot分析證實(shí)，CMCC（B）31216(serotype9V)、CMCC (B)31436(serotype3)、CMCC(B)31507(serotype7F)等8種血清型的肺炎鏈球菌均能表達(dá)Gts、PotD和SrtA蛋白，且蛋白抗原性未發(fā)生變異。粘附抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單一Gts、PotD和SrtA蛋白都能抑制D39對(duì)A549細(xì)胞的粘附，且2-3個(gè)蛋白質(zhì)抗原的聯(lián)合使用，具有明顯的累加效應(yīng)。此外，抗-Gts、抗-PotD和抗-SrtA抗血清的單獨(dú)使用或2-3個(gè)抗血清的聯(lián)合使用，也具有和蛋白抗原類似的抑制效應(yīng)。通過(guò)鼻腔滴注Gts、PotD或SrtA重組蛋白，小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生了高水平的Th1介導(dǎo)的細(xì)胞因子IFN-γ、Th2介導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-4、Treg介導(dǎo)的IL-10因子和Th17介導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-17A，誘導(dǎo)了小鼠對(duì)肺炎鏈球菌的粘膜免疫及系統(tǒng)免疫。在構(gòu)建的肺炎球菌感染的小鼠模型中，Gts、PotD或SrtA重組蛋白重組通過(guò)粘膜途徑免疫小鼠，均能有效減少19F型肺炎鏈球菌在鼻咽部及肺部的定植。與單個(gè)蛋白抗原比較，Gts+SrtA、PotD+Gts+SrtA均能顯著提高肺炎鏈球菌對(duì)肺部定植的保護(hù)作用。3個(gè)蛋白抗原聯(lián)合粘膜免疫后，對(duì)肺炎鏈球菌中致病能力最強(qiáng)的D39血清型鼻腔感染保護(hù)率可達(dá)83.3%。 腹腔免疫結(jié)果與粘膜免疫類似，幾乎所有蛋白抗原聯(lián)合都較單個(gè)蛋白的保護(hù)作用更強(qiáng)。但與蛋白兩兩組合比較，Gts+PotD+SrtA的三聯(lián)蛋白抗原的聯(lián)合腹腔免疫，其保護(hù)作用并未見明顯加強(qiáng)。被動(dòng)免疫研究提示，抗-Gts、抗-PotD和抗-SrtA抗血清聯(lián)合免疫小鼠，其對(duì)小鼠腹腔感染肺炎鏈球菌的保護(hù)作用與主動(dòng)免疫的效果相似，提示Gts、PotD及SrtA蛋白抗原通過(guò)主動(dòng)免疫激發(fā)的保護(hù)效應(yīng)與其抗體的作用密切相關(guān)。 結(jié)論：通過(guò)本研究的分析顯示，Gts、PotD及SrtA在肺炎鏈球菌中的保守性高，三種蛋白聯(lián)合抗原的兩兩組合及三種聯(lián)合，通過(guò)粘膜免疫途徑或系統(tǒng)性免疫途徑免疫小鼠，均能誘導(dǎo)小鼠對(duì)不同血清型肺炎鏈球菌感染的顯著保護(hù)效果，顯示Gts、PotD及SrtA是一組有開發(fā)潛力的候選疫苗組合。 目的：大量表達(dá)、純化肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）外膜蛋白SPD1741及SPD0280，用于晶體生長(zhǎng)、優(yōu)化和三維結(jié)構(gòu)解析。方法：分別將S.pn D39菌株的spd1741、spd0280基因克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)中，通過(guò)菌液PCR和重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定，再轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)獲得表達(dá)菌株；該菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、高效表達(dá)出帶His標(biāo)簽的可溶性融合蛋白；經(jīng)親和層析(Ni-NTA)、離子交換層析（DEAE）和分子篩層析后,獲得高純度的目的蛋白以進(jìn)行晶體生長(zhǎng)及優(yōu)化；最后收集該晶體X射線衍射數(shù)據(jù)。結(jié)果：經(jīng)純化后的SPD1741及SPD0280重組蛋白純度均達(dá)90%以上，采用懸滴氣相擴(kuò)散法培養(yǎng)的晶體，其X射線衍射能力分別達(dá)4.0和3.5。結(jié)論：本研究成功制備了高純度的SPD1741及SPD0280重組蛋白,獲得2種蛋白質(zhì)母體晶體，，并收到X射線衍射數(shù)據(jù)。本研究為SPD1741及SPD0280的三維結(jié)構(gòu)解析及其生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: Streptococcus pneumoniae (S.pn) is the main cause of human pathogenic bacteria. It is clinically widely caused by many diseases such as otitis media, septicemia, meningitis and fatal pneumonia. About 1 million 600 thousand people die from various diseases caused by Streptococcus pneumoniae every year around the world. But it does not effectively reduce the first 48 hours mortality of Streptococcus pneumoniae infection. With the abuse of antibiotics, clinically resistant strains obviously increase. Therefore, it is a positive and effective way to prevent the infection by inoculating Streptococcus pneumoniae vaccine.
The new generation of protein vaccine is the future development direction for the prevention of Streptococcus pneumoniae infection, but at present, the international protein vaccine is still in the pre clinical stage, because the protection effect of single protein is not ideal, combined protein vaccine is a hot spot at present. The protective effect of the body is a feasible way, because the protein antigen combined vaccine provides many potential targets for virulence.
Gts, PotD and SrtA proteins are all important virulence factors of Streptococcus pneumoniae. Bioinformatics analysis shows that they are conserved in Streptococcus pneumoniae and are expressed on the surface of bacteria. However, there are no reports on the systematic immune protection effect on the vaccine candidate proteins. This study is to compare Streptococcus pneumoniae, Gts, PotD and SrtA. The protective effect of single protein antigen immunized mice on Streptococcus pneumoniae infection; then using different serotypes of Streptococcus pneumoniae to detect the combination of the above protein 22 and the three protein combinations to immunize mice and compare with the single protein antigen group to evaluate the protective effect on the infection of Streptococcus pneumoniae.
Methods: in this study, the recombinant protein of Streptococcus pneumoniae Gts, PotD and SrtA was successfully prepared by gene cloning, protein expression and purification. The recombinant protein was immunized by the nasal cavity to study the antigen specific reaction, and to detect the body fluid and cell regulation response. In order to evaluate the natural pathway of Streptococcus pneumoniae infection, Gts, Pot was evaluated. The protective effect of D and SrtA recombinant protein antigen on nasal infection in mice was selected, and the D39 strains with the strongest pathogenicity in Streptococcus pneumoniae were selected to carry out the nasal attack experiment in order to construct a mouse model of Streptococcus pneumoniae pneumonia. In order to assess more fully the Gts, PotD and SrtA recombinant proteins were different to a variety of serotype Streptococcus pneumoniae infection In this study, the recombinant protein antigen was immunized in mice by abdominal cavity, and then different serotypes of Streptococcus pneumoniae were selected to study the intraperitoneal attack. After the specific antiserum was used to immunize mice, D39 Streptococcus pneumoniae was selected to carry out the nasal attack test to identify whether the protection of the recombinant protein antigen was specific. The effect of Gts, PotD and SrtA recombinant protein and its specific antiserum on the adhesion of D39 cells to A549 cells; finally, in order to further explore the change of the titer of natural antibody produced by the surface antigen of the bacterial surface antigen, Gts, PotD and SrtA, in order to further investigate the human body through Streptococcus pneumoniae infection, the study was conducted. To collect normal population and acute pneumonia patients, the titers of anti-Gts, anti-PotD and anti-SrtA antiserum in serum were determined by ELISA.
Results: on the basis of successful cloning and expression of Gts, PotD and SrtA recombinant protein, it was confirmed by Western blot analysis that CMCC (B) 31216 (serotype9V), CMCC (B) 31436 (serotype3), CMCC (31507) and other serotypes of Streptococcus pneumoniae, and protein antigenicity, were not mutated. Adhesion inhibition experimental evidence In fact, a single Gts, PotD and SrtA protein can inhibit the adhesion of D39 to A549 cells, and the combined use of 2-3 protein antigens has obvious cumulative effects. In addition, the combination of anti -Gts, anti -PotD and anti -SrtA antiserum alone or combined with 2-3 antisera also has a similar inhibitory effect with the protein antigen. Gts, Po is dripped through the nasal cavity. TD or SrtA recombinant protein, mouse splenocytes produced a high level of Th1 mediated cytokine IFN- gamma, Th2 mediated cytokine IL-4, Treg mediated IL-10 factor and Th17 mediated cytokine IL-17A, inducing mucosal immunization and systemic immunity to Streptococcus pneumoniae in mice. In the mice model of pneumococcal infection, Gts, PotD The recombinant protein of SrtA or recombinant protein can effectively reduce the colonization of 19F type Streptococcus pneumoniae in the nasopharynx and lungs. Compared with single protein antigen, Gts+SrtA, PotD+Gts+SrtA can significantly improve the protective effect of Streptococcus pneumoniae on lung colonization,.3 egg white antigen combined with mucosal immunization, to Streptococcus pneumoniae. The most effective D39 serotype nasal infection rate is 83.3%.
The results of intraperitoneal immunization were similar to that of mucosal immune. Almost all protein antigens were more protective than single proteins. But compared with protein 22, the combination of Gts+PotD+SrtA's triplet antigen was not significantly enhanced. Passive immunization was suggested to resist -Gts, anti -PotD and anti -SrtA antiserum. The protective effect of CO immunized mice on Streptococcus pneumoniae in mice is similar to that of active immunization, suggesting that the protective effect of Gts, PotD and SrtA protein antigen through active immunization is closely related to the action of the antibody.
Conclusion: the analysis of this study showed that Gts, PotD and SrtA were conserved in Streptococcus pneumoniae, 22 combination of three protein combined antigens and three combinations, and immunized by mucosal immunization or systemic immunization could induce significant protective effects on different serotype Streptococcus pneumoniae infection in mice, showing Gts, Po TD and SrtA are a group of candidate vaccine combinations with potential development.
Objective: to express and purify Streptococcus pneumoniae (S.pn) outer membrane protein SPD1741 and SPD0280 for crystal growth, optimization and three-dimensional structure analysis. Methods: the spd1741, spd0280 gene of S.pn D39 strain was cloned to the prokaryotic expression vector pET32a (+), and was identified by bacterial liquid PCR and recombinant plasmid, and then transformed. The strain E. coli BL21 (DE3) was obtained. The strain was induced by IPTG to efficiently express the soluble fusion protein with His label. After affinity chromatography (Ni-NTA), ion exchange chromatography (DEAE) and molecular sieve chromatography, the high purity target protein was obtained for crystal growth and optimization. Finally, the crystal X ray diffraction data was collected. The purity of the purified SPD1741 and SPD0280 recombinant protein was more than 90%. The X ray diffraction ability of the crystal was 4 and 3.5. respectively. The high purity SPD1741 and SPD0280 recombinant protein were prepared and 2 kinds of protein matrix were obtained. This study received the X ray diffraction data. It laid a foundation for the analysis of three-dimensional structure and biological function of SPD1741 and SPD0280.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2000009