本文選題：剛地弓形蟲 + 肌動蛋白�。� 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：實驗?zāi)康?對剛地弓形蟲肌動蛋白(TgACT)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化,分析其抗原性,觀察不同劑量rTgACT免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及最佳劑量免疫小鼠的抗弓形蟲感染的能力,探討TgACT作為弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。 實驗方法 第一部分：構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TgACT,并在大腸桿菌中高效表達(dá)。收集、純化RH株弓形蟲速殖子,提取總RNA;設(shè)計合成引物并引入EcoRI和Xho Ⅰ酶切位點,RT-PCR擴(kuò)增編碼TgActin的基因片段克隆到原核質(zhì)粒pET30a中,經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定陽性克��；在大腸桿菌BL21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定,通過稀釋復(fù)性的方法獲得大量表達(dá)蛋白,以Ni-NTA層析法純化蛋白,用兔抗弓形蟲血清做Westen blotting分析其抗原性。 第二部分：觀察不同劑量rTgACT滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。BALB/c小鼠50只隨機(jī)分為5組,免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μgrTgACT/只滴鼻免疫小鼠3次,首免與二免間隔2周,二免后1周三免,rTgACT溶于20μl PBS中,對照組用等量PBS滴鼻。三免后第14d,眼靜脈叢采血,分離血清。頸椎脫臼處死小鼠,采集小腸沖洗液、鼻咽和陰道沖洗液。ELISA法測定上述3種沖洗液IgA和血清IgG。分離脾淋巴細(xì)胞計數(shù)并培養(yǎng),ELISA法測定脾細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2和IL-4(24h)及IFN-γ(96h)水平。用rTgACT不(?)ConA刺激脾淋巴細(xì)胞,CCK-8試劑盒測定其增殖程度。確定rTgACT的最佳免疫劑量。 第三部分：觀察30μ rTgACT滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲感染保護(hù)作用。BALB/c小鼠40只隨機(jī)分為2組,用30μg rTgACT溶于20μl PBS中滴鼻免疫小鼠3次,首免與二免間隔2周,二免后1周三免,,對照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d,用8×104個速殖子/只灌胃攻擊全部小鼠,觀察小鼠健康狀況。攻擊后第30d,頸椎脫臼處死小鼠,分離計數(shù)肝、腦組織內(nèi)弓形蟲速殖子。 實驗結(jié)果 第一部分：從弓形蟲RH株cDNA中擴(kuò)增出1131bp的TgACT基因片段,并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TgACT;SDS-PAGE結(jié)果表明,目的基因在大腸桿菌BL21/DE3中以包涵體形式高效表達(dá),相對分子量(Mr)約49kDa,比預(yù)期值大約7kDa。通過稀釋復(fù)性的方法獲得大量表達(dá)蛋白,經(jīng)Ni-NTA純化后的蛋白濃度較低。用超濾濃縮管濃縮蛋白以提高蛋白濃度。Western blotting顯示純化后的rTgACT能被兔抗弓形蟲免疫血清識別。 第二部分：不同劑量rTgACT滴鼻免疫小鼠,與對照組相比,均不同程度誘導(dǎo)了小鼠特異性免疫應(yīng)答。血清弓形蟲特異性IgG,30μg、40μg組與對照組差異顯著,鼻咽、陰道沖洗液特異性IgA30μg組高與對照組(P0.05)。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果各組之間也無顯著性差異。IL-2各組之間變化無顯著差異；IL-4,與對照組相比,10gg、20μg、30μg、40μg組均增高(P0.05),各免疫組之間無顯著差異；IFN-γ,與對照組相比,10μg、20μg、30μg、40μg組均增高(P0.05),各免疫之間無顯著差異�？傊�,20μg、30μg、40μg都可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng),30μg組可以更有效地誘導(dǎo)粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。綜合分析,確定30μg為較理想免疫劑量。 第三部分：30μg rTgACT與PBS滴鼻免疫小鼠,末次免疫2周后,用8×104個速殖子/只灌胃攻擊全部小鼠攻擊后第2-20d,小鼠出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動減少、飲水及采食減少等異常表現(xiàn)。對照組小鼠死亡10只,免疫組死亡10只。免疫組肝組織內(nèi)蟲荷(速殖子數(shù))77.89±20.00×105/g顯著低于對照組肝組織內(nèi)蟲荷(速殖子數(shù))169.77±59.74×105/g(P0.05),減蟲率為54.12%；腦組織內(nèi)蟲荷(速殖子數(shù))13.20±2.54×105/g,顯著低于對照組22.29±3.35×105/g(P0.05),減蟲率為40.78%。30μg組rTgACT滴鼻免疫可以有效地抗弓形蟲感染。 結(jié)論 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TgACT并在大腸桿菌中高效表達(dá),rTgACT具有抗原性。30μg組rTgACT滴鼻免疫更有效誘導(dǎo)了黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答,并有效抵抗弓形蟲感染。
[Abstract]:experimental purpose
To clone , express and purify the TgACT gene of Toxoplasma gondii , analyze its antigenicity , observe the immune response of mucosal and systemic immune responses induced by different dose of rTgACT immune mice and the ability of the best dose - immunized mice to resist toxoplasmosis infection , and explore the possibility of TgACT as candidate antigen for toxoplasmosis vaccine .
experimental method
In the first part , the recombinant plasmid pET30a - TgACT was constructed and expressed efficiently in E . coli . The recombinant plasmid pET30a - TgACT was purified and purified , the total RNA was extracted , the synthetic primer was designed and the EcoRI and Xho I restriction sites were introduced , and the gene fragment encoding TgActin was cloned into the prokaryotic plasmid pET30a , and the positive clones were identified by double digestion , PCR and sequencing ;
The expression product was induced by IPTG in E . coli BL21 / DE3 . The expression products were identified by SDS - PAGE . The protein was purified by means of dilution and reproducibility . The antigenicity of the protein was purified by using the rabbit anti - Toxoplasma gondii serum .
In the second part , BALB / c mice were randomly divided into 5 groups . The BALB / c mice were randomly divided into 5 groups . The immune groups were immunized with 10 渭g , 20 渭g , 30 渭g , 40 渭grTgACT / L . The levels of serum IgG , IL - 2 and IL - 4 ( 24h ) and IFN - 緯 ( 96h ) were determined by ELISA . The optimal immune dosage of rTgACT was determined .
In the third part , the protective effects of 30 渭rTgACT on mice were observed . BALB / c mice were randomly divided into 2 groups . 30 渭g rTgACT was dissolved in 20 渭l PBS for 3 times . The first and second immunization days were 2 weeks , and the control group received the same amount of PBS . At the 14th day after the last immunization , the mice were killed at 8 脳 104 tachyzoites / rats .
experimental results
In the first part , 1131bp TgACT gene fragment was amplified from the cDNA of RH strain of Toxoplasma gondii , and the recombinant plasmid pET30a - TgACT was constructed successfully . The results showed that the target gene was highly expressed in the form of inclusion bodies in E . coli BL21 / DE3 .
In the second part , the specific immune responses of mice were induced in mice with different doses of rTgACT . The specific IgG , 30 渭g , 40 渭g group were significantly different from those in the control group . There was no significant difference between the specific IgA30渭g group and the control group ( P0.05 ) . There was no significant difference between the groups of IL - 2 .
IL - 4 , 10 gg , 20 渭g , 30 渭g , 40 渭g increased ( P0.05 ) , and there was no significant difference between the immune groups .
IFN - 緯 , 10 渭g , 20 渭g , 30 渭g , 40 渭g increased significantly ( P0.05 ) . In all , 20 渭g , 30 渭g , 40 渭g could induce immune response , and 30 渭g group could induce mucosal and systemic immune response more effectively .
The third part : 30 渭g rTgACT and PBS were injected into the mice . After the last immunization for 2 weeks , the mice were killed in 10 rats and the immune group died 10 . There were 77.89 鹵 20.00 脳 105 / g in the immune group and 77.89 鹵 20.00 脳 105 / g in the immune group .
The rate of worm reduction in brain tissue was 13.20 鹵 2.54 脳 105 / g , which was significantly lower than that in control group ( 22.29 鹵 3.35 脳 105 / g ( P0.05 ) .
Conclusion
The recombinant plasmid pET30a - TgACT was successfully constructed and highly expressed in E . coli . rTgACT had an antigenicity of 30 渭g rTgACT , which induced mucosal and systemic immune responses and was effective against Toxoplasma gondii infection .
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1998706