本文選題：新生隱球菌 + 泛素化　； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：新生隱球菌是臨床上重要的病原真菌，主要感染免疫功能抑制的人群，可誘發(fā)具有致命威脅的腦膜腦炎。鑒于其明確的有性繁殖周期、健全的動物模型和堅實的分子生物學研究基礎，隱球菌已經(jīng)發(fā)展成為人們研究真菌分子致病機制的一種優(yōu)秀模式病原真菌系統(tǒng)。多年的研究表明真菌病原體的毒力是一種復雜的混合體，其關鍵毒力因子之間的復雜作用關系以及內在的關鍵調控機制尚不甚明確。 泛素化是真核生物中普遍存在的一種可逆性蛋白修飾機制，，參與調控細胞內中多種重要的生物學過程，如細胞周期、信號轉導、有性繁殖、轉錄調控以及應激應答等。去泛素化酶是泛素代謝系統(tǒng)中重要的蛋白元件，主要通過加工泛素前體蛋白或循環(huán)利用泛素維持胞內自由態(tài)泛素的穩(wěn)態(tài)從而精細調節(jié)泛素介導的蛋白降解或非降解過程。 在本研究中，我們應用分子生物學方法構建了7個去泛素化酶的基因突變株，并結合體外應激應答實驗、毒力因子檢測、有性交配實驗以及多種細胞、動物模型以深入探索去泛素化酶蛋白家族對新生隱球菌生長和毒力的功能影響及分子機制。研究發(fā)現(xiàn)：與標準株和其它去泛素化酶的基因缺失株相比，UBP5基因敲除后隱球菌生長速率顯著下降，對高溫環(huán)境（37°C部分抑制，39°C完全抑制）、氧化和NO應激、高鹽離子、細胞膜/細胞壁應激原以及多種抗真菌藥物（如兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶和卡泊芬凈）敏感性顯著增高。除此之外，ubp5Δ基因突變株還表現(xiàn)出莢膜生長缺陷、黑色素分泌減少以及有性繁殖能力缺失等多種表型。Ubp5缺失可能并不影響莢膜多糖物質的合成與出胞，可能抑制了莢膜成分在酵母細胞表面的粘附與組裝過程；而其黑色素分泌的減少則可能由于其生長速率下降、銅離子代謝失調等因素的復合作用相關；其交配能力缺失主要發(fā)生于細胞融合階段，并與其對alpha性信息素基因的轉錄調控有關。去泛素化酶Ubp5可能是新生隱球菌在多種應激條件下維持胞內泛素水平穩(wěn)態(tài)的主要去泛素化酶。Ubp5的缺失可能導致胞內自由泛素水平的下降從而對泛素前體蛋白的需求量增強；而多聚泛素在野生標準株中的下調表達導致新生隱球菌出現(xiàn)類似于ubp5Δ突變株的表型變化，如生長速率下降、應激抵抗力下降、有性繁殖能力缺失以及毒力的下降，這進一步說明多聚泛素Ubi4與去泛素化酶Ubp5作用于同一通路以共同調節(jié)胞內的泛素水平的動態(tài)平衡。而且，去泛素化酶Ubp5的蛋白缺失改變了隱球菌在正常和高溫生長條件下的基因轉錄模式，例如參與調控營養(yǎng)代謝、應激應答反應以及多種基本生物學過程（如DNA復制、轉錄調控和細胞周期）的功能組基因均出現(xiàn)轉錄模式的改變。 除此之外，新生隱球菌中其它去泛素化酶的基因缺失如DOA4和OTU1對其毒力有著不同的功能影響。盡管其基因缺失株未表現(xiàn)出多種明確的毒力因子表型變化，但是doa4感染巨噬細胞和蠟蛾模型時幾乎表現(xiàn)出與ubp5一樣的嚴重毒力缺失，而Otu1則對隱球菌的致病感染發(fā)揮負向調控作用，其具體機制尚有待于進一步研究。其它去泛素化酶的缺失（如doa4和ubp13）也表現(xiàn)出某些與ubp5突變株類似的表型變化，如黑色素分泌減少、對某些抗真菌藥物敏感性增強等，這提示我們新生隱球菌去泛素化酶存在功能上的重疊性和多樣性。 我們的研究證實了去泛素化酶對新生隱球菌致病感染過程中的重要調控功能，揭示了新生隱球菌與模式酵母（釀酒酵母）的進化差異性，也為深入探討去泛素化酶及泛素系統(tǒng)在白念珠菌、煙曲霉菌等其它病原真菌毒力進化中的功能機制提供了一個重要的范本。值得重視的是，去泛素化酶抑制劑是當前抗腫瘤治療的一個熱點方向，去泛素化酶Ubp5對新生隱球菌藥物耐受、致病感染具有多重調控作用，具備成為新型抗真菌感染藥物或協(xié)同治療靶標的潛質。
[Abstract]:Cryptococcus neoformans is an important pathogenic fungus in clinic , which is mainly affected by immune function . It can induce meningoencephalitis with lethal threat . In view of its definite sexual reproduction cycle , a healthy animal model and a solid molecular biology research foundation , Cryptococcus has developed into an excellent mode pathogenic fungi system for studying the pathogenic mechanism of fungal molecules .

ubiquitination is a kind of reversible protein modification mechanism which is ubiquitous in eukaryotic organisms . It is involved in regulating many important biological processes , such as cell cycle , signal transduction , sexual reproduction , transcription regulation and stress response .

In this study , we used molecular biology method to construct 7 gene mutation strains of deubiquitination enzyme , and combined with in vitro stress response experiment , virulence factor detection , sexual mating experiment and many kinds of cell , animal model to investigate the effect and molecular mechanism of deubiquitination enzyme protein family on the growth and virulence of Cryptococcus neoformans .
The reduction of melanin secretion may be related to the decrease of its growth rate , the imbalance of copper ion metabolism and other factors .
The deletion of Ubp5 may result in the decrease of intracellular free ubiquitin level and enhance the demand for ubiquitin precursor protein .
In addition , the deletion of deubiquitination enzyme Ubp5 changes the gene transcription pattern of Cryptococcus neoformans under normal and high temperature growth conditions , for example , the function group genes involved in regulating nutrition metabolism , stress response reaction and various basic biological processes ( such as DNA replication , transcription regulation and cell cycle ) have changed in transcription mode .

In addition , the deletion of other deubiquitination enzymes such as DOA4 and OTU1 has different functional effects on the virulence of Cryptococcus neoformans .

Our study confirms the important regulatory function of deubiquitination enzyme in the process of pathogenic infection of Cryptococcus neoformans , and provides an important model for further exploring the functional mechanism of deubiquitination enzyme and ubiquitin system in virulence evolution of other pathogenic fungi such as Candida albicans , Aspergillus fumigatus and other pathogenic fungi .
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R379

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本文編號：1982991