本文選題：糖尿病 + 游離脂肪酸��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：為研究脂毒性對大血管的損傷作用，，我們利用游離脂肪酸（FreeFattyAcids,FFAs）干預(yù)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（RatAortaEndothelialCell，RAEC），探討游離脂肪酸對大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響及作用機(jī)制。 方法：原代培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（RACE），采用不同濃度的葡萄糖（5.5mmol/L,30mmol/L）及棕櫚酸（200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L）單獨或聯(lián)合作用于培養(yǎng)成功的RAEC24h、48h、72h，設(shè)立正常對照組和d-BSA對照組。①倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察；②采用細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞X棾で擼虎勖庖咦櫓舊椒諂は赴�；④应用MTT比色法檢測不同環(huán)境下FFAs對RAEC增殖的影響；⑤免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測處理前后RAEC中白細(xì)胞介素-8(IL-8),B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-celllymphoma2,bcl-2)，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2AssaciatedXprotein,bax)表達(dá)水平。 結(jié)果： ①RAEC形態(tài)學(xué)觀察原代細(xì)胞在培養(yǎng)5-7天后，在主動脈貼壁附近可見少量游出的內(nèi)皮細(xì)胞；培養(yǎng)到12-13天，可見遷移出的細(xì)胞呈片生長，70%—80%單層融合，分布密度不均。培養(yǎng)出的內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形、多角形，邊界清晰，胞漿豐富，核清晰，鋪滿后，細(xì)胞排列緊密，可見典型的“鋪路石”狀排列的單層細(xì)胞，并有接觸抑制現(xiàn)象。培養(yǎng)至7-8代后，細(xì)胞變瘦小，分泌物增多，可見細(xì)胞分化，成老化狀態(tài)。 ②細(xì)胞生長曲線大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞在傳代接種2h后開始貼壁，24h后90%細(xì)胞貼壁生長，24h-48h間細(xì)胞量有所減少，48h后可見新長出的細(xì)胞為單層、互不重疊，傳代細(xì)胞增殖速率較原代細(xì)胞增長稍快，第4-7天為對數(shù)生長期，第8-9天為平臺期。細(xì)胞生長曲線呈“S”型。 ③內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈典型的“鋪路石”狀單層排列貼壁生長，CD31相關(guān)抗原鑒定示：細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形，細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，而對照組內(nèi)未見著色，證實培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。 ④MTT檢測RAEC增殖不同劑量的棕櫚酸、葡萄糖及聯(lián)合培養(yǎng)組處理內(nèi)皮細(xì)胞24h、48h、72h后，與正常培養(yǎng)液組及d-BSA對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），其中24h低劑量PA組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；相同濃度時，24h與72h組內(nèi)比較，高糖組、高、中、低劑量棕櫚酸組差異顯著（P0.01），聯(lián)合培養(yǎng)組不同時間段差異均顯著（P0.01）；高糖組、中、高劑量棕櫚酸組48h與72h組內(nèi)比較，24h與48h組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），低劑量組24h與48h，48h與72h組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。正常培養(yǎng)液組與d-BSA組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 ⑤免疫組化法檢測結(jié)果正常對照組、d-BSA對照組培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞48h后，IL-8、BAX幾乎不表達(dá)或弱表達(dá)，兩對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。不同濃度FFAs、高糖及聯(lián)合培養(yǎng)組處理細(xì)胞后，細(xì)胞IL-8表達(dá)明顯增高，且具有劑量依賴關(guān)系，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；細(xì)胞bcl-2表達(dá)隨濃度的增高表達(dá)逐漸減弱，與正常對照組及d-BSA對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；而細(xì)胞BAX表達(dá)則隨濃度的增加表達(dá)亦增強(qiáng)，與正常對照組及d-BSA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。Bcl-2/bax比值隨葡萄糖及棕櫚酸濃度增高逐漸減低，聯(lián)合培養(yǎng)組為甚。 結(jié)論：體外培養(yǎng)并獲得7代內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察及CD31相關(guān)抗原鑒定證實本實驗成功的培養(yǎng)原代及傳代生長的內(nèi)皮細(xì)胞；本培養(yǎng)方法操作簡便，周期較短，價格低廉，內(nèi)皮細(xì)胞純度較高，適宜實驗所需。高濃度FFAs及高糖具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進(jìn)其凋亡的作用，并且具有時間濃度依賴性。這種作用機(jī)制可能是通過葡萄糖及棕櫚酸酯參與PI3K/AKT等途徑激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時炎性因子IL-8表達(dá)增加，參與并共同促進(jìn)主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
[Abstract]:Objective: To study the effect of lipid toxicity on large blood vessels, we used FreeFattyAcids (FFAs) to intervene in rat aortic endothelial cells (RatAortaEndothelialCell, RAEC) and explore the effect and mechanism of free fatty acid on the proliferation and apoptosis of rat aortic endothelial cells.
Methods: primary cultured rat aortic endothelial cells (RACE) were cultured with different concentrations of glucose (5.5mmol/L, 30mmol/L) and palmitic acid (200 mu mol/L, 400 mu mol/L, 600 micron mol/L) individually or jointly on the successful culture of RAEC24h, 48h, 72h, set up normal control group and d-BSA control group. The effect of FFAs on the proliferation of RAEC in different environments was detected by the method of TT colorimetric assay in different environments; (5) the FFAs, IL-8, B cell lymphoma / leukemia -2 protein (B-celllymphoma2, bcl-2), Bcl-2 related protein SaciatedXprotein, Bax) expression level.
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本文編號：1979753