本文選題：HBV + Tollip��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）的感染在中國(guó)高發(fā)，其持續(xù)感染易導(dǎo)致肝硬化和肝癌，嚴(yán)重危害人類健康，所以防治HBV感染成為我國(guó)傳染病研究的熱點(diǎn)。乙肝疫苗對(duì)未感染者具有明顯保護(hù)作用，但是，HBV感染尤其是慢性感染的治療仍然面臨很大的困難。目前，核苷類藥物和干擾素被廣泛用于抗HBV治療，但缺乏切實(shí)有效的長(zhǎng)期應(yīng)答效應(yīng)以及個(gè)體耐藥等因素制約了療效，亟需尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）作為一種重要的病原生物模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別HBV等病毒。TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎癥反應(yīng)和機(jī)體天然免疫中起著舉足輕重的作用，該通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子可能成為抗HBV的新靶點(diǎn)。Toll作用蛋白(Toll-interacting protein，Tollip)是TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭蛋白，它對(duì)HBV的感染有何影響是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。 本文通過(guò)構(gòu)建含HA標(biāo)簽蛋白的Tollip真核表達(dá)載體pCMV-HA-Tollip，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15，通過(guò)觀察其對(duì)HBV抗原的影響，分析TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要分子的表達(dá),以期初步闡明Tollip在抗HBV感染中的作用，為乙肝的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。具體內(nèi)容如下： 目的：構(gòu)建含HA標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-Tollip，轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)HBV抗原分泌的影響并探討其機(jī)制。 方法：1.構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA-Tollip雙酶切及DNA測(cè)序鑒定。2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒pCMV-HA-Tollip轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。3.ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)。4.Western Blot法檢測(cè)AKT、p-AKT、NF-κB的差異表達(dá)。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-HA-Tollip。2.質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞48h后，3μg空質(zhì)粒與3μg pCMV-HA-Tollip共轉(zhuǎn)染組、6μg pCMV-HA-Tollip轉(zhuǎn)染組中HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg和HBeAg分泌量明顯低于6μg空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組，對(duì)HBsAg的抑制率分別為24%和41%(p＜0.01)，對(duì)HBeAg的抑制率分別為13%和31%(p＜0.01)；與6μg空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，3μg空質(zhì)粒與3μg pCMV-HA-Tollip共轉(zhuǎn)染組和6μg pCMV-HA-Tollip轉(zhuǎn)染組中NF-κB、p-AKT的表達(dá)明顯降低(p＜0.01)，而AKT的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化。 結(jié)論：1.成功構(gòu)建pCMV-HA-Tollip重組真核表達(dá)質(zhì)粒。2.pCMV-HA-Tollip重組質(zhì)粒在HepG2.2.15細(xì)胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌，，其機(jī)制可能與抑制AKT的磷酸化和下調(diào)NF-κB的表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:Hepatitis B virus (HBV) infection is highly prevalent in China, and its persistent infection is liable to lead to cirrhosis and liver cancer, which seriously endangers human health. Therefore, the prevention and treatment of HBV infection has become a hot topic in infectious diseases research in China. Hepatitis B vaccine has obvious protective effect on uninfected patients, but the treatment of HBV infection, especially chronic infection, still faces great difficulties. At present, nucleoside drugs and interferon are widely used in the treatment of HBV, but lack of effective long-term response effect and individual drug resistance restrict the efficacy. There is an urgent need to find new therapeutic targets and drugs. Toll like receptor TLRs), as an important pathogenetic biologic pattern recognition receptor, can recognize the signal transduction pathway of virus. TLR / IL-1R, such as HBV, and play an important role in inflammatory response and innate immunity. The key signal molecule in this pathway may be a new target of anti-HBV. Toll-interacting protein Tollipase is a key junction protein in TLR/IL-1R signal transduction pathway. The influence of Toll-interacting protein on HBV infection is a problem to be discussed. In this paper, Tollip eukaryotic expression vector pCMV-HA-Tollip-containing HA label protein was constructed and transfected into HepG2.2.15. the expression of important molecules in TLR/IL-1R signal transduction pathway was analyzed by observing its effect on HBV antigen. The aim of this study was to clarify the role of Tollip in anti-HBV infection and to provide new theoretical basis and therapeutic target for the treatment of hepatitis B. The details are as follows: Aim: to construct a recombinant expression plasmid pCMV-HA-Tollip-containing HA label and transfect it into HepG2.2.15 cells to investigate the effect of pCMV-HA-Tollipase on the secretion of HBV antigen and its mechanism. Method 1: 1. Construction of eukaryotic expression vector pCMV-HA-Tollip double digestion and DNA sequencing identification. 2. 2. The expression of HBsAg and HBeAg was detected by Elisa in HepG2.2.15 cells transfected with plasmid pCMV-HA-Tollip by liposome transfection. 4. Western Blot method was used to detect the differential expression of AKTP-AKTN NF- 魏 B in HepG2.2.15 cells. The result is 1: 1. The eukaryotic expression vector pCMV-HA-Tollip.2was successfully constructed. The HBsAg and HBeAg secretion of HepG2.2.15 cells in the 3 渭 g pCMV-HA-Tollip co-transfected group was significantly lower than that in the 6 渭 g empty plasmid transfected control group after 48 hours of successful transfection of the plasmid into HepG2.2.15 cells. The inhibition rates of HBsAg and HBeAg were 24% and 41%, respectively, and those of HBeAg were 13% and 31%, respectively, and the expression of NF- 魏 Bp-AKT was significantly lower than that of 6 渭 g empty plasmid transfection group and 3 渭 g pCMV-HA-Tollip co-transfection group and 6 渭 g pCMV-HA-Tollip group, but the expression of AKT had no significant change. Conclusion 1. The successful construction of pCMV-HA-Tollip recombinant eukaryotic expression plasmid. 2. PCMV-HA-Tollip recombinant plasmid can effectively inhibit the secretion of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells. The mechanism may be related to the inhibition of AKT phosphorylation and down-regulation of NF- 魏 B expression.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1977812