本文選題：間充質(zhì)干細胞 + 臍帶血清��； 參考：《中南大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的：間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一種來源于中胚層,具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細胞。目前已成為組織修復(fù)工程和再生醫(yī)學(xué)理想的種子細胞,具有巨大的臨床應(yīng)用前景。 目前,國內(nèi)外間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)方法有多種,但傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)都需要添加胎牛血清或小牛血清。但胎牛血清增加了病毒或細菌感染風(fēng)險,異體蛋白輸入人體同時也增加了發(fā)生過敏反應(yīng)的危險。因此,尋找“人源化”胎牛血清替代品成為研究熱點。人臍帶血血清中含有豐富的細胞因子,具有采集方便,來源廣泛,對母親及胎兒無影響,CMV、EB病毒污染率低,低免疫性等優(yōu)勢,因此為臨床應(yīng)用提供了一種更安全高效的培養(yǎng)方法。 本研究工作分兩部分： 第一部分：混合人臍帶血清、自體血清與胎牛血清培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性的鑒定及各組增殖效能的比較 方法：無菌條件下取10例人骨髓標(biāo)本,采用密度梯度離心法提取單個核細胞,分別用含體積分?jǐn)?shù)為10%的混合人臍帶血清、10%的自體血清、10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,行骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng),觀察細胞形態(tài),取第3代細胞,測定細胞表面標(biāo)志及行成骨、脂肪誘導(dǎo)分化,以鑒定MSCs的生物學(xué)特性,并比較在三組培養(yǎng)體系中MSCs細胞的增殖效能。 結(jié)果：混合人臍帶血清組、自體血清組與胎牛血清組培養(yǎng)的MSCs細胞形態(tài)上無明顯差異；混合人臍帶血清組培養(yǎng)的第3代MSCs表達CD73、CD105的陽性率均在95%以上,高于自體血清組、FBS血清組(P0.05),而CD34、CD45的陽性率各組均在2%以下；混合人臍帶血清組、自體血清組、FBS組培養(yǎng)的骨髓MSCs誘導(dǎo)為成骨細胞、脂肪細胞陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)�；旌先四殠а褰M在增殖速度和細胞數(shù)量上的優(yōu)勢明顯,胎牛血清次之,自體血清組較差。 結(jié)論：混合人臍帶血清組、自體血清組、FBS組培養(yǎng)的MSCs經(jīng)鑒定均符合MSCs診斷標(biāo)準(zhǔn)；在混合人臍帶血清培養(yǎng)體系中,MSCs增殖效能優(yōu)于FBS、自體血清組。 第二部分：不同體積分?jǐn)?shù)混合人臍帶血清對間充質(zhì)干細胞增殖的影響 方法：無菌條件下取10例人骨髓標(biāo)本,采用密度梯度離心法提取單個核細胞,分別用體積分?jǐn)?shù)為5%、7.5%、10%、15%、20%的臍血清+DMEM/F12培養(yǎng)基,行骨髓間充質(zhì)細胞培養(yǎng),在原代培養(yǎng)及第三代培養(yǎng)末行細胞計數(shù),取第3代細胞,用MTT法觀察不同體積分?jǐn)?shù)的臍血清對MSCs的增殖能力的影響。 結(jié)果：在7.5%、10%體積分?jǐn)?shù)的臍血清組,擴增的細胞數(shù)量以及細胞增殖能力優(yōu)于5%、15%、20%體積分?jǐn)?shù)的臍血清組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：在7.5%、10%體積分?jǐn)?shù)臍血清培養(yǎng)體系中,MSCs增殖能力較佳。
[Abstract]:Background and objective: mesenchymal stem cells, MSCs) is a kind of adult stem cells derived from mesoderm, which has the ability of self-replication and multi-differentiation. At present, it has become an ideal seed cell for tissue repair engineering and regenerative medicine, and has a great prospect of clinical application. At present, there are many methods in vitro culture of mesenchymal stem cells at home and abroad, but the traditional culture in vitro all need to add fetal bovine serum or calf serum. But fetal bovine serum increases the risk of viral or bacterial infection, and the risk of allergic reactions is also increased by the introduction of alloproteins. Therefore, the search for a "humanized" fetal bovine serum substitute has become a research hotspot. Human umbilical cord blood serum is rich in cytokines, which has the advantages of convenient collection, wide source, low contamination rate of CMV EB virus and low immunity to mother and fetus. Therefore, it provides a more safe and efficient culture method for clinical application. This research is divided into two parts: Part one: identification of biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells cultured with mixed human umbilical cord blood serum autologous serum and fetal bovine serum and comparison of proliferative efficacy among groups Methods: the mononuclear cells were extracted from 10 human bone marrow specimens under aseptic condition by density gradient centrifugation. The DMEM/F12 medium containing 10% autologous serum and 10% fetal bovine serum containing 10% volume fraction of human umbilical cord blood was used to extract mononuclear cells. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were cultured, cell morphology was observed, cell surface markers were measured, osteogenesis and adipogenic differentiation were performed to identify the biological characteristics of MSCs, and the proliferative efficiency of MSCs cells in the three groups was compared. Results: there was no significant difference in morphology of MSCs cells between autologous serum group and fetal bovine serum group in mixed human umbilical cord blood serum group, and the positive rate of CD73 CD105 expression in the third generation of mixed human umbilical cord blood serum group was over 95%. The positive rate of CD34 + CD45 was less than 2% in all groups, and the positive rate of bone marrow MSCs was induced into osteoblasts in mixed human umbilical cord blood serum group. There was no significant difference in the positive rate of adipocytes between the two groups. The mixed human umbilical cord blood serum group had obvious advantages in proliferation rate and cell number, followed by fetal bovine serum and autologous serum group. Conclusion: the MSCs cultured in the mixed human umbilical cord blood serum group and autologous serum group were all in accordance with the diagnostic criteria of MSCs, and the proliferative efficacy of MSCs in the mixed human umbilical cord blood serum culture system was better than that in the autologous serum group. The second part: the effect of mixed human umbilical cord blood serum with different volume fraction on the proliferation of mesenchymal stem cells Methods: the mononuclear cells were extracted from 10 human bone marrow specimens under aseptic condition by density gradient centrifugation. Bone marrow mesenchymal cells were cultured in DMEM/F12 medium with volume fraction of 5 and 7.5% respectively. Cells were counted at the end of primary and third generation culture. The effect of cord blood serum with different volume fraction on the proliferation of MSCs was observed by MTT method. Results: in 7. 5% 10% volume fraction umbilical cord blood serum group, the number of expanded cells and the cell proliferation ability were better than those of 5 15% and 20% volume fraction umbilical cord blood serum group, the difference was statistically significant (P 0. 05). Conclusion: in the culture system of 7.5% 10% volume fraction of umbilical cord blood, the proliferative ability of MSCs is better.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1957362