本文選題：胞外核苷酸 + 人內(nèi)皮細(xì)胞��； 參考：《中南大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：第一章胞外核苷酸對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究 第一節(jié)胞外核苷酸對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響 目的： 觀察胞外核苷酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響。 方法： 采用不同濃度的胞外核苷酸(ATP,ADP,UTP,UDP)持續(xù)干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-Cs),通過CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)HUVEC-Cs增殖的影響及時(shí)間效應(yīng),流式細(xì)胞術(shù)觀察不同濃度的ATP/ADP對(duì)HUVEC細(xì)胞周期時(shí)相分布及細(xì)胞凋亡的影響,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及免疫熒光技術(shù)觀察高濃度的ATP/ADP對(duì)誘導(dǎo)HUVEC-Cs細(xì)胞自噬的影響,免疫印記進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的自噬活動(dòng)。 結(jié)果： 與陰性對(duì)照組相比,ATP在低濃度(1,5,10μM)時(shí)對(duì)HUVEC-Cs增殖沒有影響,ADP僅在1μM時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖,但ATP和ADP在高濃度(50,100μM)時(shí)均顯著抑制細(xì)胞增殖,且呈時(shí)間依賴性,而UTP、UDP對(duì)HUVEC-Cs增殖沒有影響；高濃度的ATP/ADP并不誘導(dǎo)HUVEC-Cs凋亡,但是顯著增加S期的細(xì)胞比例,降低G2/M期的細(xì)胞比例,對(duì)G0/G1期細(xì)胞比例沒有明顯影響；細(xì)胞自噬試驗(yàn)表明高濃度的ATP/ADP顯著誘導(dǎo)LC3-GFP融合蛋白的形成,免疫印記表明對(duì)照組與ATP/ADP干預(yù)組的HUVEC-Cs均表達(dá)高水平的LC3-1和LC3-2。 結(jié)論：高濃度的ATP/ADP通過將細(xì)胞周期阻滯于S期并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡而抑制HUVEC-Cs增殖,但并不涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 第二節(jié)ATP抑制人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制研究 目的： 闡明ATP抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的具體機(jī)制。 方法： 采用RT-PCR檢測(cè)靜息狀態(tài)下人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的P2Y受體亞型,RT-PCR、Western-blot檢測(cè)不同濃度的ATP對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P2Y2和P2Y,1的影響；通過CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)非特異性P2受體阻斷劑蘇拉明對(duì)ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的影響；shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)闡明介導(dǎo)ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的P2Y受體亞型；Western-blot檢測(cè)高濃度的ATP對(duì)Erk信號(hào)通路的活化情況,CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)ERK通路阻斷劑UO126和PD98095對(duì)ATP抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATP對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡效應(yīng)的影響,RT-PCR及P2Y11 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)闡明其可能機(jī)制。 結(jié)果： 1、RT-PCR結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下,HUVEC-Cs表達(dá)高水平的P2Y2和P2Y11受體,同時(shí)表達(dá)低水平的P2Y1,4，，13,14受體；原代的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高水平的P2Y11受體,同時(shí)表達(dá)低水平的P2Y2,4，3,14受體；RT-PCR結(jié)果表明ATP呈濃度依賴性上調(diào)HUVEC-Cs P2Y2:和P2Y11受體的mRNA表達(dá)；Western-blot結(jié)果表明ATP呈濃度依賴性上調(diào)HAECP2Y2和P2Y11受體的蛋白表達(dá)。 2、CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明高濃度的ATP對(duì)HUVEC-Cs增殖的抑制作用可以被非特異性P2受體阻斷劑蘇拉明(100μM)完全阻斷。 3、P2Y2和P2Y11 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC-Cs 24h后,RT-PCR檢測(cè)其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果表明shRNA顯著下調(diào)了HUVEC-Cs P2Y2(?)和P2Y11的mRNA表達(dá)；CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明同空白對(duì)照組相比,P2Yn shRNA組ATP在高濃度時(shí)對(duì)HUVEC-Cs增殖的抑制作用被阻斷,而P2Y2shRNA組ATP在高濃度時(shí)仍顯著抑制：HUVEC-Cs增殖。 4、Western-blot結(jié)果表明ATP在100μM時(shí)呈時(shí)間依賴性活化ERK信號(hào)通路,其誘導(dǎo)ERK磷酸化的時(shí)間從1min持續(xù)到8min,其中以4～8min時(shí)最明顯,且RATP誘導(dǎo)的ERK磷酸化可以被其特異性阻斷劑UO126所阻斷。UO126或者PD98095均可抑制或者協(xié)同ATP抑制HUVEC-Cs增殖(P＜0.05),但是并不能阻斷ATP對(duì)HUVEC-Cs增殖的抑制作用。 5、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明ATP在高濃度(50,100μM)時(shí)能顯著增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡效應(yīng)(與單用順鉑組相比,P＜0.05),RT-PCR結(jié)果表明ATP在高濃度時(shí)明顯下調(diào)Bcl-2及Bcl-2家族成員包括Bcl-w、A1和Mcl-1的mRNA表達(dá)水平,Western-blot結(jié)果表明,ATP可以協(xié)同順鉑降低Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。 6、P2Yn shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC-Cs后,ATP在高濃度(50,100μM)時(shí)下調(diào)Bcl-2mRNA表達(dá)的效應(yīng)被部分阻斷,而且順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率明顯降低(P＜0.05)。 結(jié)論： ATP在高濃度時(shí)對(duì)HUVEC-Cs細(xì)胞增殖的抑制作用由P2Y11受體介導(dǎo),該過程并不依賴于ERK信號(hào)通路的活化。高濃度的ATP通過P2Y11受體下調(diào)Bcl-2家族成員的基因表達(dá)水平,從而增強(qiáng)人內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。第二章胞外核苷酸對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其機(jī)制研究 第一節(jié)胞外核苷酸對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響 目的： 分離純化臍帶血來源的單個(gè)核細(xì)胞并誘導(dǎo)培養(yǎng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察胞外核苷酸對(duì)其增殖的影響。 方法： 采用密度梯度離心法分離人臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞,用含有多種生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)并鑒定細(xì)胞的生物學(xué)特性；采用RT-PCR檢測(cè)靜息狀態(tài)下人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)表達(dá)的P2受體亞型,并采用不同濃度的胞外核苷酸(ATP,ADP,UTP,UDP)持續(xù)干預(yù)EPCs,通過CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)EPCs增殖的影響。 結(jié)果： 1、分離培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞早期以集落為中心呈放射狀生長(zhǎng),晚期形成典型的“鋪路石”樣改變,DiL-acLDL和FITC-UEA-I雙染陽性初步鑒定其為內(nèi)皮祖細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果表明早期的EPCs表達(dá)較高水平的干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133、CD31和CD34,而弱表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物VE-Cadherin; 2、RT-PCR結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下,EPCs表達(dá)較高水平的P2X4,6,7受體和P2Y2,4,11受體,同時(shí)也弱表達(dá)P2Y13,14受體；ATP、UTP在5μM時(shí)均能上調(diào)EPCs P2Y2受體mRNA的表達(dá)； 3、與陰性對(duì)照組相比,僅ATP在高濃度(50,100μM)時(shí)顯著抑制.EPCs增殖,而ADP、UTP、UDP對(duì)細(xì)胞增殖均沒有明顯影響。 結(jié)論： 人臍血中可分離培養(yǎng)出較高純度的內(nèi)皮祖細(xì)胞；高濃度的ATP顯著抑制EPCs增殖,但介導(dǎo)該作用的P2受體亞型有待進(jìn)一步研究。 第二節(jié)胞外核苷酸對(duì)LPS誘導(dǎo)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響及可能機(jī)制 目的： 觀察低濃度的ATP. UTP對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響并闡明其可能機(jī)制。 方法： 采用RT-PCR檢測(cè)TLRs在EPCs中的表達(dá)情況及1mg/mL的LPS對(duì)EPCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響；采用RT-PCR檢測(cè)不同濃度的ATP. UTP(0,5,50μM)對(duì)EPCs表達(dá)TLR4、TLR4協(xié)同受體CD14和TLR調(diào)節(jié)蛋白MyD88的影響；采用RT-PCR檢測(cè)ATP. UTP在5μM濃度時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響；RT-PCR、Western-blot檢測(cè)ATP. UTP在低濃度時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs表達(dá)TLR4、CD14和MyD88的影響；Western-blot檢測(cè).ATP. UTP在低濃度時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs NF-κB信號(hào)通路活化情況的影響。 結(jié)果： 1. RT-PCR結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下,EPCs表達(dá)TLR1～10,其中TLR4的表達(dá)水平最高,其次為TLR2,TLR1 0和TLR3; 1mg/mL的LPS能顯著上調(diào)IL-1β、MCP-1、ICAM-1. VCAM-1.E-選擇素、IFN-a和TNF-a在EPCs中的mRNA表達(dá)水平； 2、不同濃度的ATP. UTP(0,5,50μM)干預(yù)處理EPCs后,RT-PCR結(jié)果表明ATP. UTP在5μM濃度時(shí)能顯著下調(diào)TLR4、CD14和MyD88的mRNA表達(dá)； 3. ATP. UTP在5μM濃度時(shí)能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的MCP-1,VCAM-1, IFN-α和TNF-α在EPCs中的mRNA表達(dá)水平,而對(duì)IL-1β和ICAM-1的表達(dá)無明顯影響； 4、ATP、UTP在低濃度時(shí)顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的CD14和MyD88在EPCs中的mRNA和蛋白表達(dá)水平,同時(shí)也下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TLR4mRNA在EPCs中的表達(dá)； 5、ATP、UTP在低濃度時(shí)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化。 結(jié)論： ATP/UTP在低濃度時(shí)能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子和細(xì)胞因子在EPCs中的表達(dá),該作用可能通過P2Y2受體負(fù)性調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路,最終通過抑制NF-κB的磷酸化而實(shí)現(xiàn)。
[Abstract]:Chapter one the effect of extracellular nucleotides on the proliferation of human endothelial cells and its mechanism
Effect of exonucleotides on proliferation, apoptosis and autophagy of human endothelial cells
Objective:
The effects of extracellular nucleotides on proliferation, apoptosis and autophagy of human umbilical vein endothelial cells were observed.
Method錛

本文編號(hào)：1944125