發(fā)布時間：2018-05-19 02:02

  本文選題：腫瘤壞死因子(TNF) + sTNFRII-gAD　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：腫瘤壞死因子(TNF)首先于1975年由Lloyd Old等發(fā)現(xiàn),因最初發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素能誘導(dǎo)機(jī)體一種糖蛋白的表達(dá)并引起實(shí)體性腫瘤的出血壞死而得名。TNF分游離型和跨模型,都有生物學(xué)活性�？缒Ｐ虸NF(tmTNF,26kD)經(jīng)TNF轉(zhuǎn)化酶裂解后成為游離型TNF分子(sTNF,17kD)。TNF是機(jī)體炎癥反應(yīng)的有力誘導(dǎo)因子,能調(diào)節(jié)固有性免疫并且在介導(dǎo)機(jī)體通過Thl類免疫應(yīng)答抵抗胞內(nèi)細(xì)菌及某些病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。然而,TNF表達(dá)調(diào)節(jié)失控也會導(dǎo)致多種病理作用,包括免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病(IMIDs)如D-氨基半乳糖(GaIN)/脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肝損傷、LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。因此,TNF成為這些疾病的重要治療靶點(diǎn)。 TNF受體(TNFR)分TNFRI(p55)、TNFRII(p75)兩種。由于天然狀況下TNF以同源三聚體的形式結(jié)合至體內(nèi)游離的或跨模型受體TNFRⅠ、TNFRⅡ而引發(fā)胞內(nèi)下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化引起相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)或病理生理過程,因此,模擬TNF同源三聚體形式的復(fù)合分子將能更有利于TNFR與TNF結(jié)合而拮抗模型受體與TNF的結(jié)合。目前在臨床上使用的TNF拮抗劑主要是二價(jià)分子,包括可溶性腫瘤壞死因子受體II(sTNFRII)與IgG的Fc段形成的融合蛋白(sTNFRII-Fc)和TNF單克隆抗體(如嵌合型Infliximab、人源化Adalimumab)兩大類。因市場龐大,新型高效TNF拮抗劑的研發(fā)是研究的熱點(diǎn)。 脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞和肝細(xì)胞對葡萄糖攝取和脂肪酸的氧化,降低血甘油三酯,并提高機(jī)體對胰島素的敏感性。借助脂聯(lián)素球部(gAD)可自行形成緊密同源三聚體的特性,我們研制出了三聚化的sTNFRII,即可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部(sTNFRII-gAD)融合蛋白。該蛋白能以更接近于天然TNF三聚體的形式結(jié)合TNF并拮抗其生物活性。 研究認(rèn)為,由于LPS的暴露而使TNF過度表達(dá)能導(dǎo)致肝臟受損。這一觀點(diǎn)已經(jīng)在用特異性抗體或抗血清中和循環(huán)TNF而減輕LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷作用的實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證�，F(xiàn)已研究表明,促炎癥細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)的活化(包括TNF)被認(rèn)為是臨床上嚴(yán)重肝損傷結(jié)果這一病理過程中起重要作用的環(huán)節(jié)。因此,通過拮抗體內(nèi)過度表達(dá)的TNF可以對因一些細(xì)菌特別是革蘭氏陰性菌感染而引起的內(nèi)毒素血癥(休克)起治療作用。 另一方面,盡管RA的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制不甚了解但目前以人為其為一種系統(tǒng)性、進(jìn)展性的伴隨免疫炎癥的自身免疫功能紊亂,其病理特點(diǎn)表現(xiàn)為主要引起關(guān)節(jié)滑膜損傷并導(dǎo)致軟骨破壞直至骨關(guān)節(jié)的破壞。傳統(tǒng)的疾病緩解抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)雖然能有效地改善RA患者的臨床癥狀及提高活動能力,但并未能阻止患者關(guān)節(jié)進(jìn)行性損害。有研究發(fā)現(xiàn)一方面在RA患者的炎癥性滑膜特別在關(guān)節(jié)軟骨-關(guān)節(jié)翳連接處TNF表達(dá)明顯增高；并且將人TNF基因敲入小鼠基因組后引起TNF過度表達(dá)并導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生慢性多關(guān)節(jié)炎癥,發(fā)病率達(dá)100%。所以,拮抗TNF已成為臨床治療RA的新方向。 本研究利用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備該融合蛋白,并通過內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型、研究其拮抗TNF的療效,為最終能在臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法 1. sTNFRII-gAD體外生物活性研究 1.1兩種TNF拮抗劑體外生物活性比較 ①取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后用1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞合適密度；②取96孔培養(yǎng)板,每孔加入100uL細(xì)胞懸液,置37℃,5%CO2溫箱孵育20h；③稀釋樣品sTNFRII-gAD、sTNFRII-Fc(稀釋液中含標(biāo)準(zhǔn)品TNF及放線菌素D),棄上清；④加入100μl稀釋樣品,培養(yǎng)18～20h；⑤每孔加入15μl MTT,37℃孵育4h；⑥去上清,加入DMSO,在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm處測量各孔的吸光值。 1.2體外受體-配體復(fù)合物測定實(shí)驗(yàn) ①小鼠重組TNF抗體包被96孔板；②4%BSA封閉,4℃過夜；③TBST洗滌后加入稀釋好的rmTNF-sTNFRII-gAD或rmTNF-sTNFRII-Fc反應(yīng)液；④經(jīng)洗滌,加入檢測抗體,孵育1h；⑤洗板5次,加入酶標(biāo)二抗,室溫孵育1h；⑥拍干,隨后加入TMB顯色液,放置10-20min；⑦加入終止液,450nm讀板。 2. sTNFRII-gAD對GaIN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷(ALI)的治療作用研究 2.1GaIN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷模型的建立 BALB/c小鼠隔夜禁食后經(jīng)腹腔注射GaIN/LPS混合液,陰性對照組注射等量生理鹽水,連續(xù)觀察12h。 2.2sTNFRII-gAD對GaIN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷的療效觀察 ①sTNFRII-gAD對ALI生存率的影響：實(shí)驗(yàn)分為正常對照、PBS陰性對照、sTNFRII-Fc陽性對照sTNFRII-gA組。部分小鼠(N=6)經(jīng)腹腔注射GaIN/LPS后立即治療,陰性組注射無菌PBS；另一部分小鼠(N=6)于造模后1h進(jìn)行治療。小鼠經(jīng)治療后連續(xù)觀察12h,記錄各組的生存率。②血清酶學(xué)變化： 半致死劑量GaIN/LPS造模,分別于治療后2、5h測定各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶。③sTNFRII-gAD對ALI肝臟組織病理學(xué)的影響：半致死劑量GaIN/LPS造模,治療后5h處死,立即剪取10mm3肝臟置已準(zhǔn)備好的10%中性甲醛溶液固定過夜,用于蘇木素-伊紅染色。 2.3sTNFRII-gAD對GaIN/LPS治療作用的機(jī)制研究 ①血清TNF定量及活性測定：半致死劑量GaIN/LPS造模,治療后2、5h測定血清TNF及其活性；②血清sTNFRII-gAD-TNF復(fù)合物測定：造模并經(jīng)治療后5h采血。利用雙抗體夾心法測定sTNFRII-gAD治療組血清sTNFRII-gAD-TNF復(fù)合物；③肝臟Caspase-3測定：治療后5h實(shí)驗(yàn)動物處死后立即剪取適量肝臟組織,置于-80℃用于Western bloting檢測Caspase-3;④TUNEL法凋亡檢測：治療后5h實(shí)驗(yàn)動物處死后立即剪取0.5g肝臟組織置于10%甲醛固定過夜,切片后部分用于TUNEL法觀察各組肝臟凋亡情況。 3. sTNFRII-gAD對膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)治療作用研究 3.1牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建 ①牛Ⅱ型膠原溶液加入等量佛氏完全佐劑(CFA)中,4℃攪拌過夜；②雌性Wistar大鼠尾根部皮內(nèi)注射制備好的Ⅱ型牛膠原乳劑(200μg)；③第7天再次膠原免疫(100μg)。 3.2sTNFRII-gAD對CIA的療效觀察 ①CIA發(fā)病率、嚴(yán)重程度：第二次膠原免疫后第3天將大鼠隨機(jī)分為PBS對照、sTNFRII-Fc陽性對照、sTNFRII-gAD實(shí)驗(yàn)組。正常對照為未經(jīng)膠原免疫的Wistar大鼠。自當(dāng)天開始每2天治療一次,共3次；治療前記錄各組的CIA發(fā)病率、足爪腫脹、以及關(guān)節(jié)炎臨床評分,直至第16天；②血清Ⅱ膠原抗體測定：分別于治療前(d10)、治療后(d16)采血,肝素鈉抗凝。一部分用于流式測定,其余抗凝血經(jīng)離心后用于測定抗-CII;③CIA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變：治療后2天(d16)截取大鼠踝關(guān)節(jié)置于10%中性甲醛固定,0.5%EDTA溶液脫鈣處理,經(jīng)包埋、切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。 3.3sTNFRII-gAD治療CIA的機(jī)制研究 ①外周血TNF、IL-17A測定：分別于第10、16天測定血清TNF、IL-17A水平,觀察治療前后血清TNF、IL-17A變化情況；②外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞測定：第10、16天采血抗凝后經(jīng)CD4-FITC、CD25-PE表面標(biāo)記及FOXP3-APC胞內(nèi)標(biāo)記后流式檢測治療前后外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料用x±s表示,采用Oneway-ANOVA(Bonferroni)比較計(jì)量資料組間差異,方差不齊時用Welch法法校正,采用Dunnett T3進(jìn)行兩兩比較；采用重復(fù)測量方差分析(Repeated ANOVA)比較各組不同時間點(diǎn)同一指標(biāo)的變化,球形檢驗(yàn)不滿足時采用Greenhouse-Geisser法校正。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法比較各組生存率；實(shí)驗(yàn)中非參數(shù)資料采用多個獨(dú)立樣本非參數(shù)卡方檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis).采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果 1.體外sTNFRⅡ-gAD相比sTNFRⅡ-Fc具有更強(qiáng)的TNF拮抗能力 ①體外TNF拮抗實(shí)驗(yàn)：結(jié)果顯示,在0.22～1.1nM范圍內(nèi)相對于sTNFRⅡ-Fc, sTNFRⅡ-gAD表現(xiàn)出更強(qiáng)的TNF拮抗能力,差異顯著(P0.001)；②體外配體-受體復(fù)合物測定：結(jié)果表明在檢測濃度下(600nM)TNF-sTNFRII-gAD復(fù)合物水平顯著高于TNF-sTNFRII-Fc(F=596.284,P0.001). 2.sTNFRII-gAD減輕GaIN/LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷 ①sTNFRII-gAD治療對ALI生存率的影響：當(dāng)造模后立即治療時,陰性對照組造模后4.5-7h全部死亡,陽性藥物組死亡主要出現(xiàn)在造模6h以后,其12h生存率近64%；而sTNFRII-gAD治療組生存率達(dá)100%,與模型組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。當(dāng)造模后1h治療時,sTNFRII-Fc組12h存活率為33.3%,大多數(shù)死亡發(fā)生在治療后5～7h,而sTNFRII-gAD治療組12h生存率達(dá)66.7%,并且死亡集中在治療后8h左右；與模型組比較,兩拮抗劑治療組生存率顯著升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PsTNFRⅡ-Fc=0.009；PsTNFRII-gAD=0.001),而兩TNF拮抗劑治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.127)。 ②sTNFRII-gAD治療后肝損傷減輕：為考察治療后肝臟受損情況,比色法測定血清ALT.AST以及H-E染色觀察肝臟病理學(xué)改變。血清酶學(xué)結(jié)果顯示,造模后立即治療時,在2個不同時間點(diǎn)(2、5h)四組血清ALT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=100.367,P0.001)。其中兩拮抗劑治療組的ALT水平明顯低于模型組水平且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；造模后立即治療時,四組間AST變化(2、5h)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=39.168,P0.001),與正常組比較,模型組AST變化顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)而兩種拮抗劑治療組AST變化則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PsTNFRⅡ-Fc=0.077；PsTNFRII-gAD=0.379).延后1h治療時5h各組血清酶含量顯著高于2h水平,四組間ALT水平變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=70.780,P0.001)；延后1h治療時四組AST變化組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.089,P0.001),其中sTNFRⅡ-gAD治療組與模型組(P=0.011)、陽性藥物組(P=0.002)之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 宏觀上,治療后陰性組肝臟明顯腫大、充血,在兩種治療模式下9造模后立即治療、造模后1h治療)三組肝臟/體重指數(shù)依次分別為0.049±0.001、0.061±0.002、0.052±0.002、0.050±0.001(F=104.711,P0.001)和0.050±0.001、0.065±0.001、0.054±0.002、0.053±0.003(F=32.160,P0.001),在這兩種治療模式下模型組臟臟/體重指數(shù)都明顯高于其它三組,組間差異顯著(P0.001)。另外,在造模后立即治療時,sTNFRⅡ-gAD治療組肝臟/體重指數(shù)低于陽性對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)而造模后1h延遲治療時兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)。 組織病理學(xué)方面,模型組肝損傷非常明顯,肝細(xì)胞大面積損害,很少見到完整的肝組織結(jié)構(gòu)。胞核消失,固縮、胞膜破壞、細(xì)胞間隙模糊,肝竇幾乎消失,白細(xì)胞侵潤明顯。而在sTNFRⅡ-Fc、sTNFRII-gAD治療組,肝細(xì)胞損傷情況明顯較輕,尤以后者甚為明顯。而且,造模后延遲1h治療時肝臟損傷程度比造模后立即治療嚴(yán)重。 ③sTNFRⅡ-gAD治療后血清TNF水平升高而活性變化不明顯：治療后各組外周血TNF都保持在較高的水平,其中造模后立即治療時模型組、陽性對照、實(shí)驗(yàn)藥物組在2h、5h TNF分別為441.2±176.8、1114.4±276.6、1359.3±183.5pg/ml(F=62.059,P0.001)和870.8±192.1、1830.1±78.6、1884.2±259.2pg/ml(F=193.902,P0.001),顯著高于正常對照水平(89.6±21.3pg/ml)；陽性對照組和實(shí)驗(yàn)藥物組水平顯著高于模型組,各自差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩拮抗劑治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。造模后延遲1h治療后2h、5h三組TNF分別為510.9±45.2、1050.1±71.3、1258.6±98.7pg/ml和192.5±77.6、394.8±26.4、653.2±140.9pg/ml,而正常對照組TNF水平為89.6±21.3pg/ml,方差分析表明,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F2h=193.902,P2h0.001；F5h=27.436,P5h0.001)。而且,sTNFRII-gAD治療組TNF水平顯著高于陽性對照組(P2h=0.028；P5h=0.029)。L929細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)造模后立即治療時,在治療后2、5h,TNF拮抗劑治療組TNF活性均明顯低于陰性對照組,三組間TNF變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=130.374,P0.001)；當(dāng)治療后延遲1h治療時,在相同時間點(diǎn)(2、5h)三組細(xì)胞毒作用分別為97%、80.54%、80.62%和80.13%、74.35%、74.86%,三組間TNF變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=168.219,P0.001),其中模型組TNF活性顯著高于其它兩TNF拮抗劑治療組(P0.001)。 ④sTNFRII-gAD明顯抑制ALI過程中肝細(xì)胞凋亡 為評價(jià)這兩種TNF拮抗劑對ALI肝細(xì)胞凋亡作用的影響,我們分別進(jìn)行TUNEL原位凋亡檢測肝細(xì)胞的凋亡情況以及Western blotting法檢測各組肝組織中Caspase-3的活化情況。TUNEL結(jié)果顯示,此模型中肝細(xì)胞發(fā)生了大面積凋亡,PBS治療組凋亡指數(shù)明顯高于其它兩個TNF拮抗劑治療組而正常組小鼠則未能檢測到肝細(xì)胞的凋亡。從蛋白水平看,陰性對照組5h時肝臟Caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng),并有其裂解片段的出現(xiàn),這暗示Caspase-3被活化。結(jié)果還顯示,雖然造模后立即治療時兩TNF拮抗劑治療后Caspase-3表達(dá)無差異,但在造模后延遲1h治療時sTNFRII-Fc治療組Caspase-3裂解片段表達(dá)顯著增強(qiáng)而sTNFRII-gAD治療組則幾乎不表達(dá)。 3. sTNFRII-gAD對牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)的治療作用 ①sTNFRII-gAD對大鼠CIA發(fā)病率、嚴(yán)重程度的影響 自實(shí)驗(yàn)第10天開始每隔2天觀察并記錄各組的CIA發(fā)病情況,包括發(fā)病率、足爪腫脹以及臨床評分,直至第3次治療后2天(共4次,間隔8天)。結(jié)果顯示,經(jīng)三次治療后模型組、陽性藥物組及sTNFRII-gAD治療組CIA發(fā)病率分別為100%、50%、37.5%,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=7.156,P=0.028)。其中模型組發(fā)病率高于其它兩拮抗劑治療組,sTNFRII-gAD治療組最低。 排水法測定結(jié)果顯示,隨著時間推移模型組腫脹越加明顯,其具體為1.00±0.12、1.16±0.15、1.32±0.08(ml)；而其它兩組CIA動物的足爪體積分別是：0.91±0.06、0.99±0.13、1.08±0.21(sTNFRII-Fc治療組)、0.90±0.09、0.97±0.17、1.03±0.19(sTNFRII-gAD治療組)。三組間差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.725,P=0.020),但兩TNF拮抗劑治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000),而且陽性對照組與PBS治療組之間無顯著性差異(P=0.062)。 根據(jù)普遍采用的CIA臨床評分標(biāo)準(zhǔn),每一組實(shí)驗(yàn)動物根據(jù)足爪的紅腫情況獲得一個評分。結(jié)果表明,各組其臨床評分與疾病進(jìn)展相關(guān),而且sTNFRII-gAD治療組臨床評分統(tǒng)計(jì)量即平均秩次在各觀察時間點(diǎn)均明顯低于模型組和陽性對照組。 ②sTNFRII-gAD對CIA大鼠血清anti-CII水平的影響 結(jié)果顯示,三組anti-CII水平在治療前差異不顯著(分別為7306±1354、6654±914、6659±1552pg/ml；F=0.417,P=0.668)；治療后PBS對照組為21127±3829pg/ml,陽性藥物組為14209±172pg/ml, sTNFRII-gAD治療組為8097±1248pg/ml,組間差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.235,P0.001)。其中sTNFRII-gAD治療組水平最低,顯著低于PBS對照組(P0.001)和陽性對照組(P=0.001)。 ③sTNFRII-gAD對CIA大鼠血清TNF水平的影響 ELISA法分別測定各組實(shí)驗(yàn)動物的血清TNF水平。結(jié)果顯示,除正常大鼠外(120.2±19.7pg/ml)其它三組的TNF水平均顯著升高,治療前水平分別為251.9±14.7、255.5±25.9、257.4±13.6(pg/ml),四組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.047,P0.001)；治療后陰性對照組TNF水平有一定的下降,而其它兩TNF拮抗劑治療組則明顯高于治療前,三組結(jié)果分別為228.9±33.3、319.7±28.4、358.1±18.3(pg/ml),組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.948,P0.001)。其中治療后兩拮抗劑治療組水平顯著高于PBS對照組(P0.001)而拮抗劑治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.187)。 ④sTNFRII-gAD對CIA大鼠血清IL-17A的影響 相對于正常組(12.3±1.10pg/ml),治療前各造模組IL-17A水平顯著升高,三組IL-17A水平分別為20.7±2.7、20.0±2.4、20.8±1.9,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.260,P0.001)；治療后陰性對照組IL-17A升至36.1±4.4pg/ml,而sTNFRII-Fc、sTNFRII-gAD治療組分別是21.3±2.9、19.44±1.2pg/ml,與正常組比較組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.865,P0.001),陰性對照組水平顯著高于另外兩組(P0.005),而兩TNF拮抗劑處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.700)。 ⑤sTNFRII-gAD對CIA大鼠外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg的影響 流式檢測顯示,CIA與Treg數(shù)量的下降相關(guān)。治療前各組大鼠外周血Treg水平顯著低于正常組(P0.05),四組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.253,P0.001),而這三組間相互差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)三次治療后,模型組Treg徘回在治療前水平甚至有所降低盡管前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.756,P=0.492)；而兩種TNF拮抗劑治療組水平趨于恢復(fù)至正常組水平,各自與其治療前水平相比,差異顯著(P0.001),與正常組比較差異無顯著性(P0.05)。治療后四組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.886,P0.001)。 ⑥sTNFRII-gAD治療中CIA大鼠病理組織學(xué)及影像學(xué)變化 經(jīng)脫臼處死大鼠后,部分大鼠的踝關(guān)節(jié)立即放入10%中性甲醛溶液中固定用于組織病理學(xué)檢查,部分大鼠自膝關(guān)節(jié)以下截取用于檢查踝關(guān)節(jié)影像學(xué)變化。H-E染色表明,相對于正常對照,陰性對照組踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)滑膜腔變窄、彌漫性白細(xì)胞侵潤、軟骨增生增厚、軟骨成骨界限模糊、滑膜破損嚴(yán)重,而sTNFRII-Fc和sTNFRII-gAD治療組則明顯較輕,在sTNFRII-Fc組有少許的軟骨增厚、少量白細(xì)胞侵潤而sTNFRII-gAD的組織病理學(xué)則近乎于正常組。影像學(xué)方面,PBS組有明顯的踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹以及骨質(zhì)破壞而其它兩組則無此現(xiàn)象。 結(jié)論 本研究首先經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)sTNFRII-gAD能有效地結(jié)合并拮抗TNF,并且其拮抗能力高于已商品化的同類制劑sTNFRII-Fc。在GaIN/LPS誘導(dǎo)的ALI治療實(shí)驗(yàn)中,該融合蛋白通過競爭性結(jié)合體內(nèi)過度生成的TNF而抑制該模型所致的急性肝損傷作用并在一些方面優(yōu)于sTNFRII-Fc,如體外TNF拮抗作用、抑制ALI過程中AST升高以及臟臟/體重指數(shù)。其機(jī)制可能是通過結(jié)合TNF而抑制肝細(xì)胞表面相應(yīng)受體活化最終阻礙細(xì)胞凋亡。另外,本研究表明,sTNFRII-gAD通過拮抗體內(nèi)慢性炎癥產(chǎn)生的TNF生物活性進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞分化以及促進(jìn)外周Treg恢復(fù)有效抑制或緩解Ⅱ牛膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎。因此,sTNFRII-gAD作為一種新型的TNF拮抗劑,在臨床治療一些與TNF過度表達(dá)相關(guān)疾病過程中將具有相當(dāng)?shù)臐摿�。而且本研究還表明,通過基因重組技術(shù)構(gòu)建的細(xì)胞因子受體-gAD融合蛋白拮抗相應(yīng)炎癥細(xì)胞因子從而預(yù)防或治療相關(guān)因子引起的一些炎癥性疾病的可行性,為抗細(xì)胞因子治療提出新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳素云;何秋山;董小巖;吳小兵;高基民;;可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部融合蛋白的真核表達(dá)及生物學(xué)活性檢測[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年02期

，

本文編號：1908200