本文選題：肺炎鏈球菌 + 磷壁酸�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的 磷壁酸(TeichoicAcids)是革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁上一種的多糖聚合物，是細(xì)菌表面重要的抗原[1]。spd1672基因是本課題組前期篩選出的一個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因，生物信息學(xué)分析顯示該基因在各種血清型肺炎鏈球菌中的高度保守性，其編碼產(chǎn)物具有O抗原連接酶、聚合酶結(jié)構(gòu)域。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SPD1672蛋白影響了2型肺炎鏈球菌D39菌株的毒力和磷壁酸合成，可能為磷壁酸合成酶，但其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域尚不清楚。因此本課題擬鑒定SPD1672蛋白影響磷壁酸的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，并觀察其在其它血清型肺炎鏈球菌中是否也影響到磷壁酸合成及毒力。 方法 首先通過替代失活的方法構(gòu)建肺炎鏈球菌D39（serotype2）、R6(serotype2)、203（serotype3）、TIGR4（serotype4）的spd1672基因缺陷菌株D39△1672、R6△1672、203△1672、TIGR4△1672，利用pEVP3質(zhì)粒構(gòu)建以上各菌株的周質(zhì)環(huán)external loop4（EL4）缺陷菌株和spd1672基因的回復(fù)菌株，通過突變PCR技術(shù)構(gòu)建5個(gè)周質(zhì)環(huán)點(diǎn)突變回復(fù)菌株，通過western blot檢測野生菌與缺陷菌的各亞組分中磷壁酸合成的差異，鑒定SPD1672蛋白的酶活性位點(diǎn)，并分析其在不同菌株中對壁磷壁酸（WTA）與脂磷壁酸（LTA）合成的影響；采用PJWV25及PAE03質(zhì)粒熒光報(bào)告系統(tǒng)，對SPD1672蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；通過小鼠生存率的比較、體內(nèi)定植實(shí)驗(yàn)等的毒力實(shí)驗(yàn)分析spd1672基因?qū)Σ煌逍头窝祖溓蚓玖Φ挠绊憽?結(jié)果 通過western blot分析發(fā)現(xiàn)， D39菌株缺陷周質(zhì)環(huán)EL4后的磷壁酸合成減少，與缺陷spd1672基因后相一致，說明EL4是其關(guān)鍵功能域；進(jìn)一步的酶活性位點(diǎn)分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第206、270、287、306位氨基酸點(diǎn)突變后磷壁酸的合成量同野生菌相比幾乎沒有差異，而第304位組氨酸發(fā)生點(diǎn)突變后，，其磷壁酸的合成量同缺陷spd1672基因后相一致，較野生菌顯著下降，提示該位點(diǎn)為SPD1672蛋白的關(guān)鍵氨基酸；選擇抗磷酸膽堿抗體對野生菌及各點(diǎn)突變菌株進(jìn)行的磷酸膽堿含量分析顯示，各突變株的磷酸膽堿變化與磷壁酸含量的變化一致，進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論的可靠性。spd1672基因的N末端和C末端分別與GFP融合表達(dá)后，肺炎鏈球菌的邊緣發(fā)出熒光，提示該基因表達(dá)于細(xì)胞膜上。對3型菌株203和4型菌株TIGR4的磷壁酸合成檢測結(jié)果顯示，當(dāng)缺陷spd1672基因后，缺陷菌全菌組分及各亞組分磷壁酸的合成量都顯著減少，說明spd1672基因在這兩種血清型菌株中也影響磷壁酸的合成；通過鼻腔的途徑感染小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D39△1672、203△1672、TIGR4△1672同野生菌相比，其在血、鼻咽部、肺及腦中的定植量較野生菌顯著減少，缺陷組的小鼠生存率顯著高于相應(yīng)的野生組的小鼠生存率。 結(jié)論 本研究結(jié)果提示SPD1672蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜，周質(zhì)環(huán)EL4是其重要的結(jié)構(gòu)功能域，第304位組氨酸是維持其聚合酶活性的關(guān)鍵氨基酸。spd1672基因?qū)?型、3型等血清型菌株的磷壁酸合成都有影響，且影響這些菌株在宿主體內(nèi)的定植及毒力，提示該基因?qū)Ψ窝祖溓蚓妆谒岷铣杉岸玖Φ挠绊懢哂衅毡樾浴?br/>[Abstract]:objective
Phosphoric acid (TeichoicAcids) is a polysaccharide polymer on the cell wall of Gram-positive bacteria. It is an important antigen [1].spd1672 gene on the surface of bacteria. The bioinformatics analysis shows that the gene is highly conserved in a variety of serotype Streptococcus pneumoniae. O antigen ligase, polymerase structure domain. Preliminary results show that SPD1672 protein affects the virulence and phosphoric acid synthesis of Streptococcus pneumoniae strain 2, which may be phosphoric acid synthetase, but its key domain is not clear. Therefore, this topic intends to identify the key domain of SPD1672 protein to influence the phosphoric acid acid, and to observe it in other serum. Whether Streptococcus pneumoniae affects the synthesis and virulence of phosphonic acid, too.
Method
First, by replacing the inactivation of Streptococcus pneumoniae D39 (serotype2), R6 (serotype2), 203 (serotype3), TIGR4 (serotype4), spd1672 gene defective strains D39 delta 1672, R6 Delta 1672203 delta 1672, TIGR4 delta 1672. The mutation PCR technique was used to construct 5 cycle point mutation response strains, and the difference of phosphic acid synthesis in the subcomponents of wild and defective bacteria was detected by Western blot, and the enzyme activity sites of SPD1672 protein were identified, and the effects on the synthesis of pariphiic acid (WTA) and lipophosphoric acid (LTA) in different strains were analyzed. PJWV25 and PAE03 were used. The plasmid fluorescence reporting system was used for subcellular localization of SPD1672 protein, and the effect of spd1672 gene on the virulence of different serotypes of Streptococcus pneumoniae was analyzed by comparison of the survival rate of mice and in vivo colonization experiments.
Result
The Western blot analysis showed that the phosphorus wall acid synthesis decreased after the defective cycle EL4 of the D39 strain, which was consistent with the defective spd1672 gene, indicating that EL4 was the key functional domain. Further enzyme active site analysis showed that the synthesis of phosphoric acid acid was almost no worse than that of wild bacteria after 206270287306th amino acid sites mutation. After the mutation of the 304th - bit histidine point, the synthesis of phosphoric acid was consistent with the defective spd1672 gene, which was significantly lower than that of the wild bacteria, suggesting that the site was the key amino acid of SPD1672 protein; the phosphoric acid choline content analysis of wild and point mutant strains selected by anti phosphaticholine antibody showed that the phosphorus of each mutant strain was found. The changes in acid choline were consistent with the changes in the content of phosphoric acid acid. It was further confirmed that the N and C ends of the.Spd1672 gene were fused with GFP, and the edge of Streptococcus pneumoniae emitted fluorescence, suggesting that the gene was expressed on the cell membrane. The results of the phosphoric acid synthesis detection for the 203 and 4 strains of type 3 strain TIGR4 showed that, After the defective spd1672 gene, the total and subcomponents of the defective bacteria were significantly reduced, indicating that the spd1672 gene was also affected by the synthesis of phosphoric acid in these two serotype strains. The results showed that the D39 Delta 1672203 delta 1672 and the TIGR4 delta 1672 were in the blood, nasopharynx, and lung compared with the wild bacteria through the nasal cavity. The survival rate of mice in the defect group was significantly higher than that in the wild group.
conclusion
The results of this study suggest that SPD1672 protein is expressed in the cell membrane, and the periplasmic ring EL4 is an important structural functional domain. 304th - bit histidine is the key amino acid.Spd1672 gene for maintaining its polymerase activity, which affects the phosphoric acid acid synthase of type 2 and type 3 serotype strains, and affects the colonization and virulence of these strains in the host. The effect of genes on the synthesis and virulence of pneumococcal Streptococcus pneumoniae is universal.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

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本文編號：1901990