本文選題：痢疾桿菌 + 膜復(fù)合物��； 參考：《南昌大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：痢疾桿菌是一種革蘭氏陰性病原菌,通過各種分泌系統(tǒng)將毒力蛋白分泌到外部環(huán)境或者直接注入宿主細(xì)胞。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ⅰ型到Ⅵ型共六種類型分泌系統(tǒng),都是由單個蛋白或者大分子復(fù)合物形成一個跨越細(xì)菌細(xì)胞膜的通道。由于膜蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、疏水性強(qiáng),難以從疏水的細(xì)胞膜脂雙層中完整地分離純化,因此長期以來對其研究局限于將可能的結(jié)構(gòu)蛋白一個個單獨(dú)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究,缺乏整體性。近年來由Shaegger等人建立并逐漸成熟的藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Blue Native PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,BN PAGE)為復(fù)合物研究帶來新的突破。在痢疾桿菌的致病過程中,毒力大質(zhì)粒編碼許多侵襲相關(guān)蛋白比如Ⅲ型分泌系統(tǒng)復(fù)合物及其分泌的毒力因子,它的缺失會導(dǎo)致痢疾桿菌毒性的喪失。其細(xì)胞膜上除Ⅲ型分泌系統(tǒng)復(fù)合物之外,不僅還有5種類型分泌系統(tǒng)復(fù)合物未被分離鑒定,還可能有其它一些完全未知的復(fù)合物。 本研究通過藍(lán)色非變性凝膠電泳(BN PAGE)比較痢疾桿菌福氏5型野生株M90T和大質(zhì)粒缺失株M90T△T的膜蛋白復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)一個野生株特有的復(fù)合物,其分子量約為290kDa,命名為M90T-290。通過第二向SDS-PAGE分離M90T-290得到6個蛋白亞基,質(zhì)譜鑒定為：一個由大質(zhì)粒編碼的毒力蛋白apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和5個染色體編碼的蛋白,分別為ClpB、DnaK、hypothetical protein S1768、translation elongation factor Tu、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas。M90T-290這個復(fù)合物是通過染色體和毒力大質(zhì)粒的共同調(diào)控來實(shí)現(xiàn)M90T的致病性。 鑒定出復(fù)合物的組成蛋白后,決定用標(biāo)簽親和純化技術(shù)對復(fù)合物的組成進(jìn)行了驗(yàn)證。將apyrase的編碼基因phoN2插入表達(dá)GST標(biāo)簽的PGEX 6p-1載體,構(gòu)建成功apyrase-GST融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入M90T中,命名為M90T-6p-apy;制備該轉(zhuǎn)化菌的膜蛋白復(fù)合物樣品,用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和柱純化含GST標(biāo)簽的蛋白,利用BN PAGE分離純化產(chǎn)物。結(jié)果沒有分離得到GST-apyrase融合蛋白參與形成的復(fù)合物。分析可能是GST標(biāo)簽本身分子量比較大,改變了apyrase的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)致無法形成復(fù)合物。 于是將apyrase的編碼基因phoN2插入到更小的表達(dá)His標(biāo)簽的PET 32a載體中,構(gòu)建成功apryase-His融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入BL21中,命名為BL-PET-apyrase。誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎裂解細(xì)菌收集上清,發(fā)現(xiàn)在上清中有融合蛋白。然后利用鎳柱進(jìn)行親和純化,純化得到apyrase-His融合蛋白。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的融合載體和純化的融合蛋白為以后的復(fù)合物的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。 同時為了對apyrase與M90T-290復(fù)合物的功能進(jìn)行初步探索,利用Red重組系統(tǒng)敲除M90T中apyrase的編碼基因phoN2。成功構(gòu)建了線性打靶片段。把線性打靶片段轉(zhuǎn)入含重組酶系統(tǒng)的PKOBEG感受態(tài)細(xì)胞中,通過卡納霉素抗性標(biāo)記篩選發(fā)生重組的缺失突變株。可能是由于重組效率低,目前還在篩選發(fā)生有效重組的缺失突變株。
[Abstract]:Shigella dysenteriae is a Gram-negative pathogen, secreting virulent proteins into the external environment or directly into host cells through various secretory systems. Up to now, it has been found that there are six types of secretory systems from type I to type 鈪，

本文編號：1887436