本文選題：β1腎上腺素受體 + 自身抗體　； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：研究背景 神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng),三者之間相互協(xié)調(diào)、相互平衡,從而維持機(jī)體功能的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)這種平衡被各種理化因素破壞時(shí),會(huì)導(dǎo)致病理過(guò)程的出現(xiàn)和/或某些疾病的發(fā)生。 交感神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,在維持機(jī)體功能穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。在生理情況下,交感神經(jīng)激活后,其末梢釋放的兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì),通過(guò)與分布在靶器官上的腎上腺素受體結(jié)合,來(lái)調(diào)節(jié)各種靶器官的功能活動(dòng)。有大量研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)的異常釋放與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而,在某些病理情況下,機(jī)體表現(xiàn)出交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活的現(xiàn)象并不能完全用兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)大量釋放來(lái)解釋,提示可能還有其他未知因素的參與。 上世紀(jì)九十年代以來(lái),諸多研究人員在擴(kuò)張型心肌病、原發(fā)性電紊亂以及chagas病等多種心血管疾病患者血清中發(fā)現(xiàn)有類(lèi)兒茶酚胺的物質(zhì),進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),這種物質(zhì)是針對(duì)β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)(the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AR-ECII)的自身抗體,即β1-AA(Autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor),它可以與β1-AR-ECII結(jié)合發(fā)揮類(lèi)激動(dòng)劑樣的作用,提示β1-AA可能與交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活有關(guān)。 以往人們對(duì)β1-AA的研究只局限于其對(duì)心血管系統(tǒng)的影響,隨著神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)的發(fā)展,這種自身抗體對(duì)機(jī)體的影響有待重新審視。已有研究發(fā)現(xiàn),β-AR的激動(dòng)劑異丙腎上腺素(ISO)可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。我們的前期研究用主動(dòng)免疫的方法誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生β1-AA,即用人β1-AR-ECII (人鼠同源性為100%)主動(dòng)免疫Wistar大鼠18個(gè)月后,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯障礙的同時(shí),反映大鼠T淋巴細(xì)胞活性狀態(tài)的外周血CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞比值也升高,提示β1-AA的長(zhǎng)期存在可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能發(fā)生改變。但是,主動(dòng)免疫過(guò)程是將抗原肽段注入大鼠體內(nèi),在此過(guò)程中抗原肽段本身可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生改變,因此該研究還不能得出β1-AA長(zhǎng)期存在可以直接導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)生改變的結(jié)論;另外,由于在此過(guò)程中,動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的β1-AA遠(yuǎn)高于臨床患者血清中該抗體的水平,因而用主動(dòng)免疫模型的研究結(jié)果來(lái)解釋臨床也并不合理。因此,我們需要建立血清中β1-AA濃度接近臨床實(shí)際情況的動(dòng)物模型,進(jìn)一步觀察β1-AA長(zhǎng)期存在對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的影響。 眾所周知T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中功能最重要的一類(lèi)細(xì)胞群,而T淋巴細(xì)胞的增殖是其發(fā)揮多種生物學(xué)功能的前提。已有研究報(bào)道,兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)β1-AR-cAMP-PKA、β2-AR-cAMP-PKA、β1/β2-AR-PKC以及Ca~(2+)途徑來(lái)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的功能活動(dòng)。而在大鼠的T淋巴細(xì)胞表面存在的β-AR亞型主要是β2-AR,其表面幾乎不存在β1-AR,那么,該自身抗體對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞的增殖是否有影響?如果有,是通過(guò)何種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的?Ca~(2+)又在其中扮演何種角色? 決定T淋巴細(xì)胞功能特征的關(guān)鍵因素是它們所分泌的細(xì)胞因子種類(lèi)。其中IL-2和IFN-γ是由Th1細(xì)胞合成和分泌的,反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能;而IL-4是由Th2合成和分泌,介導(dǎo)體液免疫。因此我們?cè)诒狙芯恐袡z測(cè)這些細(xì)胞因子的分泌水平來(lái)反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。 目前研究報(bào)道,在人的T淋巴細(xì)胞上可同時(shí)表達(dá)有β1-AR、β2-AR以及β3-AR。鑒于在大鼠的T淋巴細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)β1-AR,所以我們不能完全用以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)反映β1-AA對(duì)臨床患者免疫系統(tǒng)的影響。因此,我們選用人外周血T淋巴細(xì)胞,觀察β1-AA對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖和分泌的影響?并進(jìn)一步分析其途徑。 綜上所述,本課題的研究目的(1)建立與臨床患者血清中β1-AA滴度相匹配的β1-AA被動(dòng)免疫大鼠模型,觀察β1-AA長(zhǎng)期存在對(duì)機(jī)體免疫功能是否有影響?(2)以免疫磁珠分選的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,研究β1-AA對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞增殖和分泌功能的影響?(3)以免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,研究β1-AA對(duì)人T淋巴細(xì)胞的增殖和分泌功能的影響,同時(shí)探索其作用途徑如何? 第一部分β1-AA長(zhǎng)期存可以導(dǎo)致大鼠免疫系統(tǒng)功能改變 研究目的 建立與臨床患者血清中β1-AA水平相匹配的β1-AA被動(dòng)免疫大鼠模型,觀察β1-AA長(zhǎng)期存在對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。 材料和方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠,8周齡,體重180-200g。 2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1抗原肽段的合成 根據(jù)人β1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的氨基酸序列(β1-AR-ECII)(197aa-223aa,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y -N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A),由吉爾生化上海有限公司合成抗原肽段,純度95%。 2.2獲取β1-AA 選用健康的8周齡雄性Wistar大鼠作為免疫對(duì)象,隨機(jī)分為兩組: ①β1-AR-ECII肽段組即免疫組(n=40):將抗原和免疫佐劑的混合物按0.4μg/g劑量注入動(dòng)物背部皮下,每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次,共免疫8周。 ②溶劑對(duì)照組即偽免疫組(n=40):將生理鹽水和免疫佐劑的混合物以一定比例注入動(dòng)物背部皮內(nèi),每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次,共免疫8周。 用SA-ELISA (Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay)方法檢測(cè)血清中β1-AA的水平。利用MAb Trap Kit試劑盒對(duì)免疫組陽(yáng)性血清中的β1-AA及偽免疫組陰性血清中的IgG進(jìn)行提取和純化。純化后的抗體蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠凝膠電泳檢測(cè)其純度,使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。 2.3大鼠被動(dòng)免疫 β1-AA組:將提純后的β1-AA IgGs按2μg/g體重劑量經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi),每2周加強(qiáng)免疫一次,共免疫20周; 偽免疫組:將從β1-AA陰性的血清中提純的IgGs注射到大鼠體內(nèi),免疫方法和劑量同前一組。 2.4大鼠在體心功能檢測(cè) 建立被動(dòng)免疫模型后,定期(0w、4w、8w、12w、16w、20w)監(jiān)測(cè)大鼠的心功能。每組隨機(jī)抽取5只大鼠,氨基甲酸乙酯(20%,1g/kg)腹腔麻醉后,經(jīng)右頸總動(dòng)脈小心插向左心室,以出現(xiàn)特征性左心室壓力波為插入標(biāo)志后,固定導(dǎo)管,打開(kāi)動(dòng)脈夾。用BL-410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)檢測(cè)并記錄各心功能參數(shù):左心室收縮壓(Left Ventricular Systolic Pressure,LVSP)、左心室舒張末期壓(Left Ventricular End-Diastolic Pressure,LVEDP)、左心室壓力上升的最大速率(+dp/dt_(max))和左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt_(max))。 2.5大鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離 大鼠麻醉,無(wú)菌取出大鼠脾臟;用注射器內(nèi)芯研磨脾臟,過(guò)200目篩網(wǎng),獲取單細(xì)胞懸液;低滲破壞紅細(xì)胞后,獲取脾臟淋巴細(xì)胞。 2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD4+/CD8+ T淋巴細(xì)胞比值測(cè)定 取100μL外周血(1×10~6個(gè)/mL),按試劑說(shuō)明書(shū)分別加入FITC標(biāo)記的CD4抗體與PE標(biāo)記的CD8抗體,同時(shí)另設(shè)管標(biāo)記FITC或PE熒光標(biāo)記的單克隆大鼠IgG1抗體作為陰性對(duì)照,避光室溫作用20min;用PBS溶液,洗細(xì)胞3次;200μL PBS溶液重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀獲取10,000個(gè)細(xì)胞,先以陰性對(duì)照測(cè)出本底參數(shù),再進(jìn)行樣本測(cè)定,計(jì)算機(jī)讀出測(cè)定值。以T淋巴細(xì)胞CD4~+/CD8~+值評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)。 2.7被動(dòng)免疫大鼠B淋巴細(xì)胞抗體生成能力測(cè)定 用20%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)生理鹽水懸液腹腔免疫大鼠,4天后無(wú)菌取出脾臟,用PBS洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用無(wú)菌注射器針芯研磨成懸液,PBS洗滌兩次,用RPMI1640調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×10~6/mL。按照J(rèn)erne和Nordin等改良的直接及間接溶血空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定B淋巴細(xì)胞抗體生成能力�？瞻邤�(shù)量采用VilBer Lourmat capt軟件測(cè)定。 2.8大鼠心臟、肝臟、腎臟組織石蠟切片的HE染色 將石蠟切片用二甲苯脫蠟;經(jīng)各級(jí)乙醇梯度脫水后蒸餾水洗;蘇木素染色5min,伊紅染色2min;常規(guī)脫水,透明,封片,光鏡下觀察心臟、肝臟、腎臟的組織病理切片。 結(jié)果 1通過(guò)主動(dòng)免疫大鼠成功獲取β1-AA 1.1主動(dòng)免疫大鼠模型建立成功 大鼠在第一次免疫后2周,與偽免疫組相比,β1-AR-ECII肽段免疫組血清中β1-AA的OD值已由0.73±0.06升高到0.41±0.05(P0.05);到8周時(shí)免疫組血清中的β1-AA的OD值達(dá)到3.02±0.09,遠(yuǎn)高于偽免疫組0.40±0.02(P0.01),(圖1-1)。本結(jié)果提示主動(dòng)免疫模型建立成功。 1.2β1-AA蛋白定性及定量測(cè)定結(jié)果 用親和柱純化β1-AA,純化后的β1-AA經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)純度,結(jié)果有兩條帶出現(xiàn)(圖1-2),分別是IgG重鏈(55KD)和輕鏈(25KD),此條帶與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相一致,表明純化效果理想。 純化后的β1-AA經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定:蛋白濃度為8mg/mL。 2β1-AA被動(dòng)免疫大鼠模型建立成功 2.1被動(dòng)免疫過(guò)程中大鼠體內(nèi)β1-AA水平維持在一定水平 在被動(dòng)免疫前,大鼠血清中β1-AA的OD值為0.08±0.030,到被動(dòng)免疫第4周時(shí),血清中β1-AA的OD值達(dá)到0.22±0.029,明顯高于偽免疫組的OD值0.09±0.040(P0.001)。隨著被動(dòng)免疫時(shí)間的延長(zhǎng),免疫組大鼠血清中的β1-AA水平可以維持在一定水平,并且與偽免疫組相比,都有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,圖1-3)。 2.2β1-AA被動(dòng)免疫大鼠在體心功能的變化 在被動(dòng)免疫后8周,與偽免疫組相比,免疫組大鼠的左室收縮壓(LVSP)和室內(nèi)壓上升的最大速率(+dp/dt_(max))(反映左室收縮功能的指標(biāo))明顯升高,而反映左室舒張功能的指標(biāo)左室舒張末壓(LVEDP)和室內(nèi)壓下降的最大速率(-dp/dt_(max))沒(méi)有明顯變化(P0.05)。到被動(dòng)免疫第20周時(shí),與偽免疫組相比,免疫組大鼠的LVSP明顯下降、+dp/dt_(max)明顯下降、LVEDP明顯升高、-dp/dt_(max)明顯下降。(圖1-4A,B,C,D)提示:隨著被動(dòng)免疫時(shí)間的延長(zhǎng),免疫組大鼠心功能出現(xiàn)了明顯下降。 3β1-AA長(zhǎng)期存在導(dǎo)致大鼠機(jī)體免疫功能發(fā)生改變 3.1β1-AA長(zhǎng)期存在可以導(dǎo)致大鼠外周血CD4~+/CD8~+T淋巴細(xì)胞比值增加 在被動(dòng)免疫4周時(shí),β1-AA免疫組的CD4~+/CD8~+T細(xì)胞比值開(kāi)始升高,但與偽免疫組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);到免疫第8周時(shí),β1-AA免疫組的CD4~+/CD8~+比值由偽免疫組的2.00±0.45升高到免疫組2.92±0.39(P0.05),并且在被動(dòng)免疫8周以后,這種增高趨勢(shì)仍然持續(xù),到被動(dòng)免疫20周時(shí),免疫組CD4~+/CD8~+比值升高到3.49±0.42,遠(yuǎn)高于偽免疫組1.89±0.40(P0.01)(圖1-5)。 結(jié)果提示,β1-AA在體內(nèi)長(zhǎng)期存在,可以導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫功能發(fā)生改變。 3.2β1-AA長(zhǎng)期存在可以使大鼠B淋巴細(xì)胞抗體生成能力增強(qiáng) 本研究采用直接及間接溶血空斑實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定β1-AA長(zhǎng)期存在大鼠B淋巴細(xì)胞的功能(即抗體生成能力)來(lái)反映機(jī)體的體液免疫功能。結(jié)果顯示,在免疫第8周時(shí),β1-AA被動(dòng)免疫組大鼠直接溶血空斑數(shù)量和間接溶血空斑數(shù)量分別達(dá)到960±89,1527±84,與偽免疫組相比(810±67,1321±78),均有明顯增多(P0.05),并且在8周后溶血空斑數(shù)量呈持續(xù)增高趨勢(shì),到20周時(shí)這種差異更為明顯(P0.01)(圖1-6A, B)。 以上結(jié)果提示,在β1-AA長(zhǎng)期存在于體內(nèi),大鼠出現(xiàn)免疫系統(tǒng)抗體生成能力增強(qiáng),即體液免疫功能增強(qiáng)。 3.3β1-AA長(zhǎng)期存在可以導(dǎo)致大鼠心臟、肝臟、腎臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn) 被動(dòng)免疫20周時(shí),大鼠心臟進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn):在β1-AA免疫組心肌細(xì)胞排列紊亂,并且在間質(zhì)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);而偽免疫組心肌組織形態(tài)與間質(zhì)均未見(jiàn)異常(圖1-7);在免疫20周時(shí),大鼠肝臟HE染色顯示:在肝竇周?chē)写罅苛馨图?xì)胞浸潤(rùn)(圖1-8),對(duì)照組未發(fā)生明顯改變;同時(shí),免疫組大鼠腎臟的腎小球和腎小管周?chē)灿写罅苛馨图?xì)胞浸潤(rùn)(圖1-9),而偽免疫組未見(jiàn)明顯改變。 小結(jié)一 1.用純化的β1-AA長(zhǎng)期被動(dòng)免疫可建立與臨床病人抗體水平匹配的動(dòng)物模型。 2.β1-AA長(zhǎng)期存在可引發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能改變。 3.β1-AA長(zhǎng)期存在可以使B淋巴細(xì)胞抗體生成能力增強(qiáng)。 第二部分β1-AA主要通過(guò)β2-AR途徑促進(jìn)ConA激活的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖和分泌功能 研究目的 1.以免疫磁珠分選的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,研究β1-AA對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞增殖和分泌功能的影響。 2.觀察鈣離子在β1-AA促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞增殖中的作用。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康雄性Wistar大鼠。 2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1大鼠脾臟CD3~+T淋巴細(xì)胞分離 無(wú)菌取出大鼠脾臟;用注射器內(nèi)芯研磨脾臟,過(guò)200目篩網(wǎng),獲取單細(xì)胞懸液;低滲溶液破壞紅細(xì)胞后,獲取脾臟淋巴細(xì)胞;用免疫磁珠分選CD3~+的T淋巴細(xì)胞。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)分選的大鼠CD3~+T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率;采用Guava PCA CytoSoft6.0.2軟件的ViaCount模塊進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。 2.2利用免疫熒光化學(xué)方法觀察β1-AR在大鼠T淋巴細(xì)胞上的表達(dá) 將純化分離的大鼠T淋巴細(xì)胞進(jìn)行涂片,用4%的多聚甲醛室溫固定20min后,PBS漂洗三次,用含10%胎牛血清的PBS室溫封閉2h;加入特異性一抗4℃孵育過(guò)夜;PBS漂洗3次,加入二抗37℃避光孵育半小時(shí);去除二抗,加入DAPI染色液室溫作用15min以上,PBS沖洗三次,封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。 2.3實(shí)驗(yàn)分組 2.3.1觀察β1-AA對(duì)分選的淋巴細(xì)胞的增殖的影響,分為以下2組: (1)溶劑對(duì)照組:分選的淋巴細(xì)胞加入生理鹽水; (2)β1-AA處理組:分選的淋巴細(xì)胞直接加入β1-AA。 2.3.2根據(jù)T淋巴細(xì)胞的活化特性,分為以下2組 (1)溶劑組對(duì)照:分選的T淋巴細(xì)胞加入生理鹽水; (2)ConA處理組:給予分選的T淋巴細(xì)胞5μg/mL ConA預(yù)刺激72h。將激活的T淋巴細(xì)胞懸液均勻接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μL/孔),每孔分別加入20μL各種干預(yù)因素: 2.3.3為了觀察β1-AA對(duì)ConA激活的T淋巴細(xì)胞是否有促增殖作用分為以下5組 (1)溶劑對(duì)照組:生理鹽水; (2)陰性對(duì)照:β1-AA陰性血清IgGs組(0.1μmol/L); (3)陽(yáng)性對(duì)照組:不同濃度的β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素組(ISO,0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L); (4)不同濃度的β1-AA組(0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR抗原肽段組(3μmol/L); 2.3.4為了觀察不同干預(yù)對(duì)β1-AA對(duì)ConA激活的T淋巴細(xì)胞增殖的影響分為以下10組 (1)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β1-AA(0.1μmol/l)+β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1-AA(0.1μmol/l)+β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β1-AA(0.1μmol/l)+β-AR阻斷劑Propranolol組(1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)β1-AA(0.1μmol/l)+PKC抑制劑Chelerythrine Chloride(1μmol/L); (7)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L)+PKC抑制劑Chelerythrine Chloride(1μmol/L); (8)β1-AA(0.1μmol/l)+L-Ca通道阻斷劑維拉帕米(1μmol/l) (9)β1-AA(0.1μmol/l)+IP3受體阻斷劑肝素(1μmol/l) (10)β1-AA(0.1μmol/l)+鈣釋放活化的Ca2+通道(CRCA)阻斷劑SKF96365(1μmol/l) 2.3.5為了觀察單獨(dú)的阻斷劑對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響分為以下6組 (1)β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β-AR阻斷劑Bupranolol組(1μmol/L); (5)PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)PKC抑制劑Chelerythrine(1μmol/L); 2.4用CCK-8法檢測(cè)大鼠T淋巴細(xì)胞增殖 將上述加入各種干預(yù)的T淋巴細(xì)胞置5%CO_2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)48h,之后每孔加入10μL CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)2h后,由于生成的甲佨物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,在酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)λ=450nm處讀取各孔的OD值,進(jìn)行細(xì)胞增殖分析,以上各組重復(fù)8次。 2.5 ELISA法測(cè)定T淋巴細(xì)胞cAMP水平以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ及IL-4含量 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品100μL加入酶標(biāo)板中,置37℃孵育60~90min;用洗板液充分洗板4次;每孔加酶標(biāo)抗體工作液,置37℃孵育60~90min;用洗板液充分洗板4次;每孔加底物工作液,置37℃避光反應(yīng)15min;用洗板液充分洗板4次;每孔加終止液,混勻后即刻于酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。 2.6 T淋巴細(xì)胞胞漿中鈣離子水平的測(cè)定 采用前述方法分離的大鼠T淋巴細(xì)胞ConA刺激后,取細(xì)胞懸液,在避光條件下,加入鈣熒光指示劑Fluo-3/AM(3μmol/L)37℃孵育30min,之后用PBS液漂洗3次,每次5min,靜置10min。將負(fù)載了Fluo-3/AM指示劑的淋巴細(xì)胞懸液加入共聚焦專(zhuān)用皿中,采用激光掃描共聚焦掃描顯微鏡(Olympus,FV1000)進(jìn)行觀察,熒光強(qiáng)度(F值)來(lái)表示胞漿中鈣離子水平。 結(jié)果 1大鼠脾臟CD3~+T淋巴細(xì)胞分選成功 首先將用免疫磁珠分選的大鼠CD3~+T淋巴細(xì)胞用抗FITC-CD3~+的抗體通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞占到92.2%(圖2-1);隨后,用Guava流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定,分選后的活細(xì)胞95%,光鏡下細(xì)胞形態(tài)均一,提示T淋巴細(xì)胞分選成功(圖2-2,2-3)。 2大鼠T淋巴細(xì)胞表面無(wú)β1-AR的表達(dá) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證在大鼠T淋巴細(xì)胞表面是否表達(dá)β1-AR,本研究利用免疫熒光化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn):DAPI染色的淋巴細(xì)胞的核呈蘭色,在陰性對(duì)照組(圖2-4A)和實(shí)驗(yàn)組(圖2-4B)均沒(méi)有檢測(cè)到FITC標(biāo)記二抗的綠色熒光。提示:在大鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞表面沒(méi)有檢測(cè)到β1-AR的表達(dá)。 3β1-AA對(duì)免疫磁珠分選后未經(jīng)ConA激活的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖沒(méi)有影響 由于用免疫磁珠分選的大鼠T淋巴細(xì)胞中,除了含有大量的T(90%-95%)外,含有少量的其他單核細(xì)胞,同樣為了檢測(cè)β1-AA對(duì)T細(xì)胞以及其他單核細(xì)胞是否有直接作用,我們將β1-AA直接加入免疫磁珠分選后的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn):β1-AA對(duì)這些細(xì)胞的增殖沒(méi)有作用(P0.05)(圖2-5) 4 ConA可以促進(jìn)大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖 免疫磁珠分選的大鼠T淋巴細(xì)胞中加入ConA后,OD值達(dá)到0.38±0.04,明顯高于未加ConA的對(duì)照組的0.18±0.05(P0.01),提示ConA可以激活大鼠T淋巴細(xì)胞(圖2-6)。 5β1-AA可以濃度依賴(lài)性的促進(jìn)ConA激活的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖 在ConA激活的T淋巴細(xì)胞中,分別加入0.01,0.1,1μM的β1-AA,結(jié)果發(fā)現(xiàn):OD值分別由原先的0.37±0.04,0.38±0.06,0.42±0.04升高到0.50±0.04,0.61±0.02,0.68±0.05( P0.01; P0.01; P0.01),提示β1-AA可濃度依賴(lài)性地促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖(見(jiàn)圖2-7)。從陰性血清中提取的IgGs不能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖;β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)與該抗體進(jìn)行預(yù)孵育,中和抗體后,該抗體促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖作用消失(圖2-8)。 6β1-AA促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞的增殖的途徑 為了進(jìn)一步驗(yàn)證β1-AA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖是否可以通過(guò)β2-AR,本研究發(fā)現(xiàn):β1-AR阻斷劑Atenolol對(duì)β1-AA的促增殖作用沒(méi)有影響,但是可以被β2-AR阻斷劑ICI118,551、β1-AR和β2-AR的拮抗劑Nadolol以及非特異性的β-AR阻斷劑Bupranolol完全阻斷;單獨(dú)的Atenolol、ICI118,551、Nadolol以及Bupranolol對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖沒(méi)有作用(圖2-9A,B),這一結(jié)果提示β1-AA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖作用可以通過(guò)β2-AR。加入β1-AA后,大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞胞漿中cAMP水平升高,但是β1-AR阻斷劑Atenolol對(duì)于cAMP的升高沒(méi)有影響,并且這種cAMP的升高可以被β2-AR阻斷劑ICI118,551、β1-AR和β2-AR的阻斷劑Nadolol完全阻斷(圖2-10);進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),PKA的阻斷劑H-89以及PKC的抑制劑chelerythrine均只能部分阻斷β-AA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖;而PKA的抑制劑H-89和PKC的抑制劑chelerythrine共同作用,可以完全抑制β-AA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖(圖2-11)。 這一結(jié)果提示:β1-AA刺激大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖可能主要是通過(guò)β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC途徑。 7鈣離子在β1-AA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖中的作用 7.1β1-AA可以促進(jìn)ConA激活的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣的明顯升高 在ConA刺激的大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中加入β1-AA后,胞內(nèi)的鈣離子的平均熒光強(qiáng)度F值由200±8.5升高到628±25(P0.01),并且,β1-AA升高胞內(nèi)鈣的作用可以基本被β2-AR受體阻斷劑ICI118,551完全阻斷(P0.05)(圖2-12,2-13)。 這一結(jié)果提示:β1-AA可以通過(guò)激活β2-AR使淋巴細(xì)胞中的胞內(nèi)鈣水平升高。 7.2阻斷胞漿中鈣離子的水平的升高可以不同程度抑制β1-AA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖 為進(jìn)一步研究鈣離子在β1-AA促進(jìn)ConA刺激T淋巴細(xì)胞增殖中的作用,本研究將ConA激活的T淋巴細(xì)胞分別用L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜IP_3受體( IP3 R)阻斷劑肝素以及CRAC通道抑制劑SKF96365預(yù)處理后,發(fā)現(xiàn):β1-AA的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖作用可以被部分抑制。(圖2-14) 8β1-AA可以促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高 β1-AA(0.01,0.1,1μM)可濃度依賴(lài)性地促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高(圖2-15A,2-16A,2-17A);這種細(xì)胞因子水平的升高不能被β1-AR阻斷劑Atenolol阻斷,可以被β2-AR受體阻斷劑ICI118,551以及β1-AR和β2-AR的阻斷劑Nadolol、β-AR的非特異性阻斷劑Bupranolol完全阻斷(圖2-15B,2-16B,2-17B)。 小結(jié)二 1.β1-AA可以通過(guò)β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC通路促進(jìn)大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖。 2.β1-AA可以通過(guò)促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞胞漿中鈣離子水平升高進(jìn)而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。 3.β1-AA可以促進(jìn)大鼠T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4分泌增加。 第三部分β1-AA促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖和分泌功能 研究目的 以免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象,研究β1-AA對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖和分泌功能的影響,同時(shí)探索其作用途徑。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康成人外周血。 2.實(shí)驗(yàn)方法 2.1人外周血CD3~+T淋巴細(xì)胞的分選 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞;并用免疫磁珠分選CD3~+ T淋巴細(xì)胞。 2.2實(shí)驗(yàn)分組 2.2.1觀察β1-AA對(duì)分選的淋巴細(xì)胞增殖的影響 (1)溶劑對(duì)照組:分選的淋巴細(xì)胞加入溶劑生理鹽水; (2)β1-AA處理組:分選的淋巴細(xì)胞直接加入β1-AA。 2.2.2觀察β1-AA對(duì)分選的T淋巴細(xì)胞活化特性的影響 (1)溶劑對(duì)照組:分選的T淋巴細(xì)胞加入溶劑生理鹽水。 (2)ConA組:給予分選的T淋巴細(xì)胞5μg/mL ConA預(yù)刺激72h。將激活的T淋巴細(xì)胞懸液均勻接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μL/孔),每孔分別加入20μL各種干預(yù)因素: 2.2.3觀察β1-AA對(duì)ConA激活的T淋巴細(xì)胞是否有促增殖作用 (1)溶劑對(duì)照組:生理鹽水; (2)陰性對(duì)照:β1-AA陰性血清IgGs組(0.1μmol/L); (3)陽(yáng)性對(duì)照組:不同濃度的β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素組(ISO,0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L); (4)不同濃度的β1-AA組(0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR抗原肽段組(3μmol/L); 2.2.4觀察不同干預(yù)對(duì)β1-AA對(duì)ConA激活的T淋巴細(xì)胞增殖的影響 (1)β1-AA(0.1μmol/l)+β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β1-AA(0.1μmol/l)+β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1-AA(0.1μmol/l)+β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β1-AA(0.1μmol/l)+β-AR阻斷劑Propranolol組(1μmol/L); (5)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)β1-AA(0.1μmol/l)+PKC抑制劑Chelerythrine Chloride(1μmol/L); (7)β1-AA(0.1μmol/l)+PKA抑制劑H-89(1μmol/L)+PKC抑制劑Chelerythrine(1μmol/L); 2.2.5觀察單獨(dú)的阻斷劑對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響 (1)β1-AR阻斷劑Atenolol組(1μmol/l); (2)β2-AR阻斷劑ICI118,551組(1μmol/L); (3)β1/β2-AR阻斷劑Nadolol組(1μmol/L); (4)β-AR阻斷劑Bupranolol組(1μmol/L); (5)PKA抑制劑H-89(1μmol/L); (6)PKC抑制劑Chelerythrine(1μmol/L); 2.3 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法檢測(cè)人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖 見(jiàn)第二部分 2.4采用ELISA試劑盒檢測(cè)T淋巴細(xì)胞cAMP水平以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、IL-4 含量 見(jiàn)第二部分 結(jié)果 1β1-AA對(duì)分選的無(wú)ConA刺激的人T淋巴細(xì)胞增殖無(wú)影響 由于用免疫磁珠分選的人T淋巴細(xì)胞中,除了含有大量的T(90%-95%)淋巴細(xì)胞外,還含有少量的其他單核細(xì)胞,為了檢測(cè)β1-AA對(duì)T淋巴細(xì)胞以及少量單核細(xì)胞是否有直接作用,我們將β1-AA直接加入免疫磁珠分選后的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn):β1-AA對(duì)這些細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響(P0.05)(圖3-1)。 2 ConA可以促進(jìn)人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖 免疫磁珠分選的人外周血T淋巴細(xì)胞中加入ConA后,未加ConA的對(duì)照組的OD值由原先的0.13±0.04升高到0.38±0.06(P0.01)(圖3-2),提示ConA可以激活人外周血T淋巴細(xì)胞。 3β1-AA可以促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞增殖 3.1β1-AA可以濃度依賴(lài)性的促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖 我們分別將濃度為0.01μM,0.1μM,1μM的β1-AA加入ConA刺激的人外周血T淋巴細(xì)胞中,經(jīng)CCK-8法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)OD值分別由加入前的0.39±0.04,0.40±0.03,0.42±0.04,增加為0.47±0.05(P0.05),0.61±0.04 (P0.01)和0.67±0.05(P0.01)(見(jiàn)圖3-3),提示β1-AA可以濃度依賴(lài)性地促進(jìn)ConA刺激的人外周血T淋巴細(xì)胞增殖。為了證實(shí)該抗體作用的特異性,本研究選用從陰性血清中提取的IgGs作為陰性對(duì)照作用于ConA刺激的T淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)OD值0.38±0.04改變?yōu)?.40±0.01(P0.05),提示此種IgG不能促進(jìn)ConA刺激T淋巴細(xì)胞的增殖;用合成的β1-AR-ECII與該抗體進(jìn)行預(yù)孵育,將β1-AA中和后,OD值由單純加入自身抗體時(shí)的0.61±0.04變化為0.39±0.009,提示β1-AA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖作用消失(P0.01)(圖3-4)。 以上結(jié)果提示,β1-AA可以促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖。 3.2β1-AA促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的可能機(jī)制 4.2.1β1-AA促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖可以通過(guò)β1-AR-cAMP-PKA途徑 為了探討β1-AA對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用是否通過(guò)β1-AR-cAMP-PKA途徑,本研究進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。 將ConA激活的T淋巴細(xì)胞分別采用β1-AR阻斷劑Atenolol和β-AR阻斷劑Bupranolol預(yù)處理后,發(fā)現(xiàn)OD值由0.61±0.04分別變化為0.50±0.05(P0.05)和0.40±0.03(P0.01),提示β1-AA的促增殖作用不能被β1-AR的阻斷劑Atenolol完全阻斷,但可以被β-AR阻斷劑Bupranolol完全阻斷(圖3-5A);單獨(dú)的Atenolol和Bupranolol對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響(P0.05) (圖3-5B),這一結(jié)果提示,β1-AA促進(jìn)ConA激活的T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)可以部分通過(guò)β1-AR發(fā)揮。加入β1-AA后,胞漿中cAMP水平由加入前的120±6.8 pmol/mL增加為300±7.5pmol/mL(P0.01),提示β1-AA可以使胞漿中cAMP水平升高,再分別加入β1-AR的阻斷劑Atenolol和β-AR阻斷劑Bupranolol以后,cAMP水平分別改變?yōu)?01±8.3(P0.05)和125±8.9(P0.01),提示CAMP水平的升高不能被β1-AR阻斷劑Atenolol完全阻斷,但可以被β-AR阻斷劑Bupranolol完全阻斷(圖3-6);進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),PKA的抑制劑H-89也只能部分降低β1-AA促進(jìn)的T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng),OD值由0.61±0.04變化為0.51±0.03(P0.05)(圖3-7A),而單獨(dú)的H-89對(duì)ConA刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響(P0.05)(圖3-7B)。 這一結(jié)果提示:β1-AA有可能部分通過(guò)β1-AR-cAMP-PKA途徑,促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖。除了此途徑外,可能還有其他通路參與。 3.2.2β1-AA促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖可以部分通過(guò)β2-AR-cAMP-PKA途徑 為了進(jìn)一步分析β1-AA促進(jìn)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的作用途徑,本研究將β2-AR阻斷劑ICI118,551以及β1-AR和β2-AR阻斷劑Nadolol分別作用于β1-AA處理的的T淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其促增殖作用也只能被ICI118,551部分阻斷,但是,Nadolol可以完全阻斷β1-AA的促T淋巴細(xì)胞的增殖作用(圖3-8A),阻斷劑本身對(duì)ConA激活的T淋巴細(xì)胞增殖沒(méi)有影響(圖3-8B),這一結(jié)果提示β1-AA的促增殖作用可以通過(guò)β2-AR進(jìn)行。而且升高的cAMP水平不能被ICI118,551完全阻斷,但可以被Nadolol完全阻斷(P0.05)(圖3-9)。 這一結(jié)果提示:β1-AA促進(jìn)ConA激活的人T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)除了通過(guò)β1-AR外,還有β2-AR-cAMP-PKA途徑參與。3.2.3β1-AA促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的增殖還可以通過(guò)β1/β2-AR-PKC途徑 鑒于β1-AA的促增殖作用不能完全被PKA抑制劑H-89所完全阻斷,本研究選用PKC的抑制劑chelerythrine(白屈菜赤堿)作用于T淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其可以部分抑制β1-AA促進(jìn)的T淋巴細(xì)胞的增殖作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),PKC和PKA的抑制劑共同干預(yù)也可以完全抑制β1-AA促進(jìn)的T淋巴細(xì)胞的增殖(圖3-10)。 由于β1/β2-AR的激活均可以激活PKC,那么,在β1-AA促進(jìn)人T淋巴細(xì)胞的增殖過(guò)程中涉及到的PKC是來(lái)自β1-AR還是β2-AR的激活,本課題進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):首先將β2-AR受體途徑阻斷(ICI118,551),再加入PKA的抑制劑H-89,發(fā)現(xiàn),β1-AA的促增殖作用不能完全阻斷,繼續(xù)加入PKC抑制劑chelerythrine后,β1-AA的促增殖作用才可完全被阻斷(圖3-11)。而先將β1-AR受體途徑阻斷(Atenolol),然后再加入H-89,也發(fā)現(xiàn)β1-AA的促增殖作用不能完全阻斷,再加入chelerythrine后,其增殖作用才可完全被阻斷(圖3-12)。 這一結(jié)果提示:β1/β2-AR-PKC通路也是β1-AA促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞增殖的途徑之一。 4β1-AA可以促進(jìn)ConA激活的人外周血T淋巴細(xì)胞的分泌功能T淋巴細(xì)胞不同功能的發(fā)揮取決于分泌細(xì)胞因子的種類(lèi),本研究檢測(cè)了IL-2,IFN-γ以及IL-4的分泌水平來(lái)反映機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能。我們將不同濃度(0.01,0.1,1μM)的β1-AA分別作用于ConA刺激的人外周血T淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)IL-2的分泌水平由加入前的26.3±3.1pg/ml,25.0±2.5 pg/ml,26.8±2.8pg/ml分別增加為33.2±2.4pg/m(lP0.05),42.0±3.0pg/ml( P0.01)和51±2.8pg/ml(P0.01),IFN-γ的分泌水平由43±3.2pg/ml,44±2.5pg/ml,46±4.1pg/ml增加為53±2.6pg/ml(P0.05),68±3.0pg/ml(P0.01)和73±3.4pg/ml(P0.01),IL-4的分泌水平增加為33.0±3.2pg/ml(P0.05),48.0±4.2pg/ml(P0.01)和51±3.9pg/ml(P0.01),遠(yuǎn)高于處理前的24.0±2.6pg/ml,22±3.1 pg/ml和23±3.7pg/ml,提示β1-AA可濃度依賴(lài)性地促進(jìn)ConA刺激的人外周血T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ以及IL-4水平(圖3-13A,3-14A,3-15A)。但是,從陰性血清中提取的IgGs不能促進(jìn)這些細(xì)胞因子的生成增加,β1-AA促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌這些細(xì)胞因子的作用可以被β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)的抗原肽段中和(圖3-13B,3-14B,3-15B),提示:β1-AA可以促進(jìn)這些細(xì)胞因子的分泌。并且,這些細(xì)胞因子水平的升高可以分別被β1-AR的選擇性阻斷劑Atenolol和β2-AR的阻斷劑ICI118,551部分阻斷;可以被β-AR的阻斷劑Bupranolol以及β1-AR和β2-AR阻斷劑Nadolol完全阻斷(圖3-13C,3-14C,3-15C),提示:β1-AA可以通過(guò)β1/β2-AR促進(jìn)這些細(xì)胞因子的分泌。 小結(jié)三 1.β1-AA能夠濃度依賴(lài)性促進(jìn)ConA刺激的人外周血T淋巴細(xì)胞增殖,并且這種作用可能是通過(guò)激活β1-AR和β2-AR(β1/β2-AR)兩條途徑實(shí)現(xiàn)的。 2.β1-AA可以通過(guò)β1/β2-AR促進(jìn)人外周血T淋巴細(xì)胞的分泌功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R33

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1 蔣理,鄧曉萱;老年人外周血大顆粒淋巴細(xì)胞的觀察[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;1998年04期

2 張彩,田志剛,王郡甫,劉金生,張建華,許曉群,孫江;人外周血NK細(xì)胞3種純化方法的比較[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2000年01期

3 董立坤,王文愷,張士民,張秀蘭,崔玉順,倪斌;抗人外周血和胸腺淋巴細(xì)胞血清的研究[J];現(xiàn)代免疫學(xué);1984年01期

4 申慶祥,李昌麟,沈惠,劉海湖,項(xiàng)翠琴,丁訓(xùn)誠(chéng);人絨毛膜促性腺激素β亞基(β-hCG)cDNA在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其產(chǎn)物對(duì)離體小鼠淋巴細(xì)胞的影響(簡(jiǎn)報(bào))[J];實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào);1996年01期

5 譚筱江,鄔夢(mèng)麒,凌世淦;rhIL-1β對(duì)γ射線(xiàn)急性照射小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響[J];上海免疫學(xué)雜志;1998年03期

6 李月紅,張祥宏,邢凌霄,左連富,嚴(yán)霞,王俊靈,王鳳榮;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抑制體外培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞低分子量蛋白酶體-2表達(dá)[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2005年03期

7 李艾黎;馬冬雪;孟祥晨;;乳桿菌對(duì)原代淋巴細(xì)胞中Th1/Th2細(xì)胞平衡的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年04期

8 秦樹(shù)林,朱圣庚,王愛(ài)霞,肖志壯,郭振泉,黃儀秀;脂多糖誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞集落刺激因子[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;1994年03期

9 陳鈺,劉成貴,黃艷;超抗原誘導(dǎo)人外周血T細(xì)胞分化的研究[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;1995年04期

10 龔曼麗,李寅增;rhTPO對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)[J];云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1999年S3期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 任利成;黃曉元;龍劍虹;;琥珀酸對(duì)人外周血中性粒細(xì)胞凋亡的影響[A];第四屆全國(guó)燒傷救治專(zhuān)題研討會(huì)燒傷感染救治新進(jìn)展論文匯編[C];2006年

2 喬海法;劉振偉;萬(wàn)勤;周文霞;張永祥;;人外周血和小鼠脾淋巴細(xì)胞電壓依賴(lài)性K~+通道的特點(diǎn)研究[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第六屆應(yīng)用生理學(xué)委員會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

3 徐東平;福軍亮;金磊;張輝;周春保;鄒正升;趙景民;施明;丁熙來(lái);湯紫榮;付陽(yáng)新;張玲霞;王福生;;乙型肝炎患者外周血和肝組織CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特點(diǎn)和意義[A];第五屆全國(guó)肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

4 李莉;黃麗麗;;米非司酮對(duì)人外周血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響[A];2009中國(guó)杭州生殖健康學(xué)術(shù)論壇暨浙江省計(jì)劃生育學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

5 王偉;楊肅文;張宏娟;魏建波;;類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血FoxP3~+CD4~+CD25~+T細(xì)胞的檢測(cè)及意義[A];浙江省免疫學(xué)會(huì)第六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2007年

6 王傲雪;齊曉怡;林茂;于洋;胡瑩;涂彩霞;;芍藥苷對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞的影響(摘要)[A];第五屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

7 葛薇;李長(zhǎng)虹;張偉;韓欽;鄧為民;尤勝?lài)?guó);趙春華;;白血病細(xì)胞凍融物沖擊的DCs增強(qiáng)人外周血CIK細(xì)胞抗腫瘤免疫研究[A];第九屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

8 王峰;薛勤;汪年松;晏春根;高許萍;張曉光;俞崗;崔勇平;唐令詮;;活動(dòng)期類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血CD62P的表述[A];首屆全國(guó)中青年風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2004年

9 薛勤;汪年松;高許萍;張曉光;范瑛;唐令詮;;強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血CD62P的改變及意義[A];第十二屆全國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

10 王建明;閻小萍;;強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血T輔助細(xì)胞亞群的變化[A];第十二屆全國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 陳四清;“中藥抗癌”要說(shuō)清楚[N];遼寧日?qǐng)?bào);2000年

2 陳代雄邋本報(bào)記者 余昌旭;遵醫(yī)附院實(shí)施我省首例新一代腫瘤過(guò)繼免疫治療[N];貴州日?qǐng)?bào);2008年

3 吳一福;MTHFRC667T基因分型技術(shù)問(wèn)世[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

4 本報(bào)記者　 王華鋒;今年花開(kāi)別樣紅[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

5 馮磊;解毒法能明顯改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡病變進(jìn)程[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2008年

6 大辛;胰島素與糖尿病[N];新疆科技報(bào)(漢);2000年

7 通訊員 吳延華 記者 海霞;阿膠二次開(kāi)發(fā)獲新突破[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2003年

8 陶春祥;NO的抗炎作用研究[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

9 周愛(ài)誼;白細(xì)胞減少應(yīng)吃什么[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2001年

10 ;檢測(cè)艾滋病人外周血細(xì)胞內(nèi)病毒新方法問(wèn)世[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王瑾;抗β1-腎上腺素受體自身抗體對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和分泌功能的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 李莉;米非司酮對(duì)人外周血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和功能的影響[D];浙江大學(xué);2010年

3 梁晨;干擾素-γ與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)協(xié)同作用機(jī)制研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

4 池詔丞;甲胎蛋白對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能及其凋亡的影響[D];吉林大學(xué);2007年

5 吳塵軒;增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞及其相關(guān)exosome抗肝癌免疫效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

6 郝勝華;移植病人淋巴細(xì)胞P-gp表達(dá)水平的改變及其臨床意義的研究[D];中南大學(xué);2008年

7 王輝;在T淋巴細(xì)胞中生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其功能的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1999年

8 欒好江;B淋巴細(xì)胞中生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2001年

9 賈嫻嫻;CCK-8對(duì)人外周血漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和活化的調(diào)節(jié)[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

10 袁紅艷;人源陽(yáng)離子抗菌肽hCAP-18/LL-37的基因克隆與真核表達(dá)及其對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟的影響[D];吉林大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 盛明雄;苦杏仁甙免疫活性和抗腎臟纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

2 禚守蓉;XGD-1對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞增殖和IL-2R表達(dá)的影響[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2003年

3 俞文淵;IL-12、IFN-γ協(xié)同共刺激分子B7-1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞腫瘤免疫的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2003年

4 杜珍;β-胡蘿卜素補(bǔ)充對(duì)青年和老年人群機(jī)體細(xì)胞功能影響的研究[D];青島大學(xué);2005年

5 侯震暉;不明原因早期自然流產(chǎn)體外反應(yīng)體系中蛻膜淋巴細(xì)胞增殖和絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡[D];四川大學(xué);2004年

6 李林;黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注小鼠及其免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用[D];暨南大學(xué);2009年

7 孫臣心;姬松茸多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性研究[D];東北師范大學(xué);2009年

8 林祥吉;山仔水華微囊藻毒素對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及其機(jī)理研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

9 田野;膠體金對(duì)小鼠免疫活性影響的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 殷玉俊;間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究[D];江蘇大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：1884356