本文選題：CGRP + MG-63�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一種感覺神經(jīng)肽,在骨組織中的分布廣泛,主要分布于骨代謝活躍的部位,直接或間接地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化及活性。目前的研究表明CGRP在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。有關(guān)CGRP在成骨細(xì)胞正常代謝中的具體機(jī)制國內(nèi)外的研究較多,但對細(xì)胞蛋白表達(dá)的研究較少。本研究尋找與CGRP相互作用、且在成骨愈合過程中起重要作用的蛋白,并且通過免疫熒光等技術(shù)確定它們在信號通路中的上下游關(guān)系,從而探討CGRP在骨創(chuàng)傷愈合過程中的可能作用機(jī)制。 目的: 探討CGRP作用下成骨樣細(xì)胞MG-63內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化。 方法: 傳代培養(yǎng)MG-63成骨樣細(xì)胞,隨機(jī)分為CGRP組和對照組。通過MTT比色法檢測細(xì)胞生長曲線并進(jìn)行統(tǒng)計分析。提取各組MG-63內(nèi)蛋白質(zhì),經(jīng)雙向電泳分離、考馬斯亮藍(lán)染色后掃描分析蛋白質(zhì)表達(dá)變化,選取6個差異顯著的蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切、肽質(zhì)量指紋圖譜分析和IPI數(shù)據(jù)庫檢索。并對檢索出的差異蛋白HRNR Hornerin通過western blot及免疫熒光方法進(jìn)行驗證。 結(jié)果: 1、MTT比色法檢測表明,CGRP實(shí)驗組和對照組細(xì)胞生長曲線有顯著性差異。 2、雙向電泳可分離(967±17)個蛋白質(zhì),點(diǎn)匹配率為(85.1±1.4)% ,成骨樣細(xì)胞6種蛋白點(diǎn)出現(xiàn)明顯差異表達(dá),與對照組比較,CGRP組6種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。 3、質(zhì)譜分析鑒定出核糖體結(jié)合蛋白p180(p180/ribosome receptor)及鈣結(jié)合蛋白HRNR Hornerin等5種蛋白質(zhì),前者與核糖體定位和合成的新蛋白轉(zhuǎn)位有關(guān),而后者可影響細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的。 4、通過對HRNR Hornerin的western blot及免疫熒光分析,發(fā)現(xiàn)HRNR Hornerin在CGRP實(shí)驗組中表達(dá)顯著下降。 結(jié)論: 1、CGRP作用于成骨樣細(xì)胞(MG-63)后,顯著促進(jìn)MG-63生長,實(shí)驗組與對照組MTT細(xì)胞生長曲線差異顯著。 2、通過雙向電泳,發(fā)現(xiàn)CGRP可誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞(MG-63)6個蛋白點(diǎn)發(fā)生表達(dá)的差異性明顯,說明CGRP可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)含量或傳導(dǎo)通路的途徑發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。 3、質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定出的差異顯著的蛋白質(zhì)可能在CGRP作用下成骨樣細(xì)胞(MG-63)中發(fā)揮著直接或間接的作用。CGRP可能通過這幾種蛋白參與第二信使及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)并發(fā)揮功能。 4、采用western blot及免疫熒光染色方法分析,MG-63培養(yǎng)液加入CGRP作用24h后,細(xì)胞質(zhì)中HRNR Honerin表達(dá)降低,證實(shí)了質(zhì)譜分析結(jié)果。分析鈣離子結(jié)合蛋白HRNR Honerin在CGRP作用于成骨樣細(xì)胞MG-63中發(fā)揮著重要作用。CGRP可能通過調(diào)節(jié)鈣離子濃度這一途徑促進(jìn)成骨樣細(xì)胞MG-63的生長,從而最終在骨折愈合中發(fā)揮作用。
[Abstract]:Calcitonin gene-related peptidine (CGRP) is a kind of sensory neuropeptide, which is widely distributed in bone tissue and mainly distributes in the active site of bone metabolism, directly or indirectly regulates the differentiation and activity of osteoblasts and osteoclasts. Current studies have shown that CGRP plays an important role in fracture healing. The specific mechanism of CGRP in the normal metabolism of osteoblasts has been studied more at home and abroad, but the expression of cell protein is less studied. In this study, we looked for proteins that interact with CGRP and play an important role in osteogenesis healing, and used immunofluorescence techniques to determine their upstream and downstream relationship in signal pathway. To explore the possible mechanism of CGRP in bone wound healing. Objective: To investigate the changes of protein expression profile in MG-63 of osteoblast like cells treated with CGRP. Methods: MG-63 osteoblast-like cells were subcultured and randomly divided into CGRP group and control group. Cell growth curves were measured by MTT colorimetry and analyzed statistically. The proteins in MG-63 were extracted and separated by two-dimensional electrophoresis. After Coomassie brilliant blue staining, protein expression was scanned and analyzed. Six protein spots with significant difference were selected for endonuclease digestion, peptide mass fingerprint analysis and IPI database retrieval. The identified differential protein HRNR Hornerin was verified by western blot and immunofluorescence. Results: 1MTT colorimetric assay showed that the growth curve of CGRP group was significantly different from that of control group. 2, 967 鹵17) proteins were separated by two dimensional electrophoresis, and the point matching rate was 85.1 鹵1.4%. The expression of six protein spots in osteoblast-like cells was significantly different, and the expression of six proteins in CGRP group was down-regulated compared with the control group. 3. Five proteins, ribosomal binding protein (p180(p180/ribosome receptor) and calcium-binding protein (HRNR Hornerin), were identified by mass spectrometry. The former was related to ribosomal localization and translocation of synthesized new proteins, while the latter could affect intracellular calcium concentration. 4. By western blot and immunofluorescence analysis of HRNR Hornerin, it was found that the expression of HRNR Hornerin decreased significantly in CGRP experimental group. Conclusion: (1) the growth curve of MTT cells in the experimental group and the control group was significantly different from that in the control group and the osteoblast like cell line MG-63 (P < 0.01). 2. By two dimensional electrophoresis, it was found that CGRP could induce the expression of MG-63 protein in osteoblast like cells, which indicated that CGRP might play a regulating role by regulating protein content or conduction pathway. 3. The differential proteins identified by mass spectrometry may play a direct or indirect role in osteoblast like cells (MG-63) under the action of CGRP. CGRP may participate in the regulation and function of the second messenger and cytokines through these proteins. (4) western blot and immunofluorescence staining were used to analyze the decrease of HRNR Honerin expression in the cytoplasm after 24 h exposure to MG-63 medium, which confirmed the results of mass spectrometry. It is analyzed that calcium binding protein (HRNR Honerin) plays an important role in MG-63 of osteoblast like cells acting on CGRP. CGRP may promote the growth of osteoblast like MG-63 by regulating the concentration of calcium ion, and finally play a role in fracture healing.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：1875126