本文選題：可誘導(dǎo)慢病毒 + 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《青島大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的：研究攜帶hBMP-2的tet-on慢病毒載體對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后hBMP-2在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。 方法：按照文獻(xiàn)方法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,消化傳代,轉(zhuǎn)染前一天,選取3.4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUCMSCs按照融合度40%接種到六孔板中,第二天進(jìn)行pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA、pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP2共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后8h更換培養(yǎng)液。待培養(yǎng)24h之后用嘌呤霉素和G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選。提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),確定基因是否已成功轉(zhuǎn)入。選取穩(wěn)定篩選后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,分別在不同強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)濃度相同誘導(dǎo)時(shí)間和不同誘導(dǎo)時(shí)間相同強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)濃度情況下用ELISA測(cè)定hBMP-2的表達(dá)情況。。對(duì)轉(zhuǎn)染前后的HUMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),用茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果：攜帶hBMP-2的tet-on慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,且HUCMSCs可以通過強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)可控性表達(dá)hBMP-2。在相同誘導(dǎo)時(shí)間情況下,強(qiáng)力霉素10μg/ml時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng),而在相同誘導(dǎo)濃度下,hBMP-2的表達(dá)在誘導(dǎo)48h后達(dá)峰值。HUCMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后,茜素紅染色示細(xì)胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。 結(jié)論：攜帶hBMP-2的tet-on慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,并初步研究了hBMP-2在體外強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究hBMP-2誘導(dǎo)HUCMSCs成骨分化治療骨壞死模型奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并提供了一種新的實(shí)驗(yàn)思路。
[Abstract]:Objective: To investigate the expression of hBMP-2 Tet-on lentivirus vector in the transfection of human umbilical cord mesenchymal stem cells (human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUCMSCs) and the expression of hBMP-2 under the induction of doxycycline.
Methods: human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured in accordance with the methods of literature and digested. The day before transfection, the 3.4 generation of HUCMSCs with good growth status were selected to be inoculated into six pore plates according to the fusion degree 40%. In second days, pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA, pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP2 were co transfected, and 8h was replaced after transfection. After 24h, purine was used. A stable screening of mycophenin and G418 was carried out. DNA was extracted and PCR was detected to determine whether the gene had been successfully transferred. The stable screening of umbilical cord mesenchymal stem cells was selected, and the expression of hBMP-2 was determined by ELISA under the same induction time of the induced concentration of doxycycline and the induced concentration of the same doxycycline at different induction time, respectively. Before and after transfection, HUMSCs was induced by osteogenesis and alizarin red staining was used to observe the formation of mineralized nodules.
Results: the tet-on lentivirus carrier with hBMP-2 can transfect human umbilical cord mesenchymal stem cells successfully, and HUCMSCs can express the strongest expression of hBMP-2. at the same induction time with the induction time of doxycycline under the same induction time. At the same induction concentration, the expression of hBMP-2 can reach the peak.HUCMS after the induction of 48H. After 2 weeks of osteogenic induction, alizarin red staining showed that there were a large number of red calcified matrix deposits in the cytoplasm of Cs.
Conclusion: the tet-on lentivirus carrier carrying hBMP-2 was successfully transfected into human umbilical cord mesenchymal stem cells, and the expression of hBMP-2 induced by doxycycline in vitro was preliminarily studied, which lay the foundation for further study on the osteonecrosis model of HUCMSCs osteogenesis induced by hBMP-2, and provided a new experimental idea.

【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1858903