本文選題：外切多聚磷酸鹽水解酶 + 分枝桿菌��； 參考：《西南大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。全球近1/3的人口感染結(jié)核菌。隨著人類社會和藥物治療的發(fā)展,人們對結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的生物學(xué)特性有了進一步的研究,繼而研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物,使得人類對結(jié)核病的控制取得了可喜的成績,遏制了結(jié)核病的蔓延和傳播。然而由于化學(xué)藥物的不合理應(yīng)用、艾滋病與結(jié)核病聯(lián)合感染、人口流動的增加以及耐藥結(jié)核病菌的流行,使得近年來結(jié)核病疫情下降緩慢,在部分地區(qū)甚至有所回升。當(dāng)前,在結(jié)核病控制工作中急需有效的預(yù)防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的藥物作用靶點和開發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)前最為關(guān)注的焦點。 多聚磷酸鹽(polyP)是由幾個到幾百個無機磷酸鹽單體通過高能磷酸鍵聚合而成的線性多聚體,廣泛分布于自然界和生物體。polyP在生物體中起到重要功能,包括基因表達和調(diào)控、DNA的攝取、微生物的運動性、對脅迫和饑餓的應(yīng)答、病原菌的毒性、以及對乳腺癌細胞的增殖、血液凝固、細胞鈣化、線粒體功能的調(diào)節(jié)等。細胞內(nèi)參與polyP代謝的酶包括內(nèi)切酶、外切酶、葡萄糖激酶、NAD激酶和AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶等。細胞內(nèi)合成和分解polyP的兩個主要酶分別是多聚磷酸鹽激酶(polyphosphate kinase, PPK)和外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase, PPX)。結(jié)核分枝桿菌中的PPK已經(jīng)得到一定程度的研究。結(jié)核分枝桿菌的ppkl基因的表達下調(diào)與藥物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān),表明多聚磷酸鹽代謝與抑制轉(zhuǎn)錄過程的聯(lián)系。Kamakshi Sureka等報道ppkl涉及結(jié)核分枝桿菌在低氧,變性劑壓力和氧化壓力條件下的存活。其作用機制為：而MprB優(yōu)先利用多聚磷酸鹽將MprA磷酸化,從而促進sigE的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的SigE調(diào)節(jié)嚴(yán)緊應(yīng)答調(diào)節(jié)子rel的轉(zhuǎn)錄。Ppkl的表達下降導(dǎo)致結(jié)核菌在巨噬細胞中存活能力的下降,表明ppkl在細菌的細胞內(nèi)生活起到重要的功能。此外,另一個多聚磷酸鹽激酶PPK2能利用多聚磷酸鹽將GDP轉(zhuǎn)化為GTP,維持GTP的平衡。核苷酸庫的平衡對許多生理過程非常重要,例如,結(jié)核分枝桿菌一個重要的細胞壁組份——脂阿拉伯甘露聚糖就是從1-磷酸甘露糖和GTP合成。實驗證實ppk2的表達下調(diào)損傷其在巨噬細胞中的生存能力,意味著ppk2在分枝桿菌定居于巨噬細胞起到重要的生理功能。 然而,作為參與polyP代謝的另一個酶PPX目前的研究還很少,其在分枝桿菌中的生理功能還有待進一步揭示。因此,開展對該蛋白的功能和性質(zhì)的研究,有助于進一步對結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)的存活和免疫逃逸機制的研究。 系統(tǒng)進化分析表明結(jié)核分枝桿菌中的Rv0496和Rv1026可能具有外切多聚磷酸酶活性。利用PSIPRED服務(wù)器的GenTHREADER程序搜尋,發(fā)現(xiàn)風(fēng)產(chǎn)葉菌的PPX/GPPA蛋白與結(jié)核分枝桿菌的Rv1026和Rv0496具有最高的結(jié)構(gòu)相似性�；陲L(fēng)產(chǎn)葉菌的PPX/GPPA的二級結(jié)構(gòu),我們用已研究的PPX序列與結(jié)核分枝桿菌中的同源蛋白進行序列對比。發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌外切多聚磷酸酶具有與風(fēng)產(chǎn)葉菌PPX的活性位點Glu121禾(?)Arg93相對應(yīng)的殘基Glu和Arg,結(jié)核分枝桿菌PPX存在焦磷酸結(jié)合位點Asp22, Arg267, Glu144和Glu211對應(yīng)的殘基,還具有富含甘氨酸的磷酸鹽結(jié)合環(huán)(P-loop Gly143-Ser146)。目前關(guān)于Rv0496和Rv1026基因的研究主要來自于轉(zhuǎn)座子突變篩選研究。兩個基因都與結(jié)核分枝桿菌的致病性相關(guān),其中Rv0496是T細胞抗原,Rv1026在感染巨噬細胞時被誘導(dǎo)表達。然而,Rv0496和Rv1026是否真正具有外切磷酸酶活性還沒有得到實驗證實。 本研究中,從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲取H37Rv的Rv1026基因序列,并以此設(shè)計一對引物。然后以H37Rv的基因組為模板,PCR擴增出Rv1026基因。PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,并亞克隆到表達載體pMV261上。重組質(zhì)粒通過PCR反應(yīng),限制性酶切反應(yīng)和測序證實,質(zhì)粒構(gòu)建成功。然后將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒點轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌。37℃培養(yǎng)重組恥垢分枝桿菌,誘導(dǎo)表達目的基因,我們發(fā)現(xiàn)改變的菌落形態(tài),生物膜形成能力的降低,而且這種改變對非離子變性劑Tween80敏感。由于恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)和生物膜形成能力與細胞壁脂質(zhì)成分相關(guān),并提取了重組恥垢分枝桿菌和對照菌的細胞壁脂肪酸,進行氣相色譜分析。發(fā)現(xiàn)重組和對照菌之間存在四個峰的差異�？傊�,我們實驗證實了Rv1026具有多聚磷酸鹽外切酶活性,并發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌細胞內(nèi)多聚磷酸鹽的減少,導(dǎo)致恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)的改變和生物膜形成能力的減少,這種改變對Tween80敏感。
[Abstract]:Tuberculosis is an infectious disease which is seriously harmful to human health . With the development of human society and drug therapy , the biological characteristics of Mycobacterium tuberculosis have been further studied .


PolyP ( polyP ) is a linear polymer formed by polymerization of several hundreds of inorganic phosphate monomers through high - energy phosphate bond . It is widely distributed in nature and organism . PolyP plays an important role in organism , including gene expression and regulation , DNA uptake , microorganism ' s motility , response to stress and hunger , toxicity of pathogenic bacteria , and regulation of breast cancer cell proliferation , blood coagulation , cell calcification , NAD kinase and AMP phosphotransferase . PPK in M.tuberculosis has been studied to some extent . The downregulation of ppkl gene of M.tuberculosis is associated with drug - induced transcription inhibition , suggesting that polyphosphate metabolism plays an important role in the inhibition of transcription . The mechanism of action is : while MprB preferentially utilizes polyphosphate to phosphorylate MprA to maintain the balance of GTP . The expression of ppkl is important for many physiological processes . For example , the expression of ppk2 reduces its viability in macrophages , meaning that ppk2 regulates the viability of macrophages in macrophages , meaning that ppk2 plays an important physiological function in the colonization of macrophages .


However , the present study of PPX , another enzyme involved in polyP metabolism , is still rare , and its physiological function in M.tuberculosis remains to be further revealed . Therefore , studies on the function and properties of the protein contribute to the further study of the survival and immune escape mechanisms in M.tuberculosis cells .


The results of phylogenetic analysis showed that Rv0496 and Rv1026 in Mycobacterium tuberculosis could have the activity of exo - polyphosphatase . The PPX / GPPA protein was found to have the highest structural similarity with Rv1026 and Rv0496 of Mycobacterium tuberculosis . Currently , studies on Rv0496 and Rv1026 genes are mainly derived from transposon mutation screening studies . Both genes are associated with the pathogenicity of M . tuberculosis , where Rv0496 is a T cell antigen and Rv1026 is induced to express when macrophages are infected . However , whether Rv0496 and Rv1026 truly have exo - phosphatase activity has not been experimentally confirmed .


In this study , the Rv1026 gene sequence of H37Rv was obtained from the GeneBank database , and a pair of primers were designed . The PCR products were ligated to pMD19 - T vector and subcloned into the expression vector pMV261 .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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